2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

骨髄からの樹状細胞の調製は、免疫系の2光子イメージングにおけるin vitroまたはin vivo実験に使用可能な抗原提示細胞の優れた供給源となります。抗原提示細胞を導入することで、生体内のリンパ節という環境における抗原特異的な細胞間相互作用の研究が可能になります。本ビデオでは、骨髄の無菌的な単離および成熟樹状細胞を産生するための培養技術について解説します。

さらに、1日目から11日目までの樹状細胞の分化過程を追跡します。この分化過程は、静止画およびScent Technologies社のIncuSiteを用いて撮影したインキュベーター内ビデオで示します。最後に、骨髄由来樹状細胞が鏡像リンパ節において、OT-II T細胞にOVA抗原を提示する様子を示します。

こんにちは。私はカリフォルニア大学のMicah Halen研究室に所属しているMelanie Matthewです。細胞が成長している間、内部で何が起きているのか不思議に思ったことはありませんか？今日はそれを解説します。

本プロトコルの手順として、まず施設内のいくつかの機器の使用方法を説明します。インキュサイト（Incucyte）を使用すると、インキュベーター内で細胞培養の増殖を追跡することができます。このプロトコルでは、マウスから骨髄由来の樹状細胞を単離し、調製する方法を説明します。

まず、大腿骨の摘出と骨髄の分離方法について説明します。まず、動物をピンで固定します。次に、動物の体に70% ethanolを塗布します。動物の中央線に沿って、最初の切開を行います。

次に、ここでお見せしているように脚の内側を切断します。大腿骨の上の筋肉組織を露出させるため、筋肉を脇に寄せ、解剖用ピンセットで大きな大腿骨を掴めるようにしてください。ピンセットで骨を保持したまま、骨に沿って下方へ移動し、関節のすぐ下で最初の切断を行います。

次に、大腿骨の長さに沿ってハサミを動かし、できるだけ体に近づけて切断します。この際、特に大腿動脈を切断すると、少量の出血が起こる可能性があります。大腿骨を取り出す際は、骨を損なわずにそのままの状態に保つことが非常に重要です。

ここでご確認いただけるように、骨の両端は切断されたり損傷したりしていません。大腿骨を取り出した後、余分な組織をクリップで切り取り、大腿骨をPMI培地を入れた小さなディッシュに入れます。余分な組織を取り除く際は、大腿骨が乾燥しないように注意してください。

この時点で、大腿骨を70% ethanolを含むディッシュに移し、氷上に5〜10分間置きます。このビデオでは、引き続き実験台で操作を行いますが、実験のこの段階からは、すべての操作を組織培養フード内で行ってください。

骨をエタノールに浸した後、骨髄を除去するために、骨を滅菌培地を入れた大きめのディッシュに移します。これで、骨髄の除去と再懸濁を行う準備が整いました。インスリン用シリンジに滅菌培地を満たし、後で使用するために傍らに置いておきます。

滅菌済みのピンセットで骨をつかみます。破片を捨てるための小さなプレートの上に骨を保持し、骨の両端の骨端を切除します。インスリン用注射器を骨の一端に挿入し、骨髄を15 mLの培地へと洗い出します。

骨髄がすべて洗い流されるまで、さらに1〜2回骨を洗浄します。骨髄が洗い流されると、骨はほぼ完全に白くなります。洗浄した骨を廃棄用ディッシュに入れ、もう一方の大腿骨でも同様の手順を繰り返します。

完了後、洗浄工程で分散しなかった骨髄の塊を穏やかに分散させ、単一細胞懸濁液を作成します。これにはピペッティングで5〜10分かかります。単一細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移し、10 mLの培地でプレートを少なくとも3回洗浄します。

毎回、細胞を遠心分離して沈殿させ、培地を除去した後、チューブの底を指で強く手早くかき混ぜて細胞を再懸濁させます。赤血球（RBC）を除去するために、水ライシスを行います。赤血球除去の別の方法として、塩化アンモニウムライシスがあります。

どちらの手法も、以前のJoVEビデオ記事で詳述されています。マウスリンパ節からのCD4陽性T細胞の単離についてはJoVE第9号（MACS精製法）、ラットサイトカインからのT細胞増殖因子の調製についてはJoVE第10号をご参照ください。

RBC（赤血球）を除去した後、細胞の培養準備が整いました。樹状細胞の培養手順を説明する前に、インキュサイトについてご紹介します。インキュサイトを使用すると、インキュベーター内での樹状細胞の増殖を追跡できるため、細胞がどのように挙動するか、あるいは不適切な挙動を示すかを確認することができます。

培養セットアップ後、適切なサイズのトレイに配置し、IncuCyteのサイトを閉じます。次に、コンピューターで時間間隔を設定し、撮影したいウェルを選択すれば、IncuCyteが自動的にデータを収集します。本プロトコルの動画では、in vitroにおける樹状細胞の形態変化を示します。

これらのビデオはIncusサイトプログラムから直接書き出されたものです。樹状細胞が1日目から11日目にかけて分化するにつれ、細胞が肥大し樹状細胞の表現型へと変化する真の形態変化を確認することができます。溶血させて赤血球を除去した後、細胞を一次樹状細胞培地で洗浄し、1mlあたり5 million個で播種します。

これらの細胞は、まず一次樹状細胞培養培地で培養し、その後、40 ng/mLのIL-4および100 ng/mLのTNF-αを添加した二次DC培地で培養します。これらのサイトカインは、単球由来樹状細胞に類似した成熟樹状細胞への分化を促進します。それでは、培養過程における細胞の状態と、経時的な維持方法について説明します。

細胞を播種した後、最初の培地交換まで樹状細胞を72時間培養することができます。ここでは、1日目に細胞を播種した直後の典型的な培養状態を示します。そして、こちらが細胞の様子です。

3日目には、細胞がプレートに接着し始めていることが確認できますが、典型的な樹状細胞の表現型はまだ呈していません。4日目には、培地を除去し、新鮮な一次DC用培地を10 mL添加して培地を吸引します。4日目に、リンパ球およびその他の非接着細胞を除去します。

ここで、最初の播種から7日後となるよう、さらに3日間インキュベーターに戻します。典型的な培養状態は以下のようになります。これで、細胞を継代し、再播種するタイミングであることがわかります。

7日目に、培地を吸引し、300 mMの滅菌EDTAを添加して5分間インキュベートすることで、プレートから樹状細胞を回収します。次に、プレートを45度の角度に保持し、プレートの背面に向けてEDTA溶液をピペッティングして、繰り返し洗浄します。付着しているすべての樹状細胞を完全に取り除くため、この操作を数分間行います。

細胞を50 mLコニカルチューブに回収し、二次DC培地で2回洗浄します。その後、細胞を再懸濁し、1プレートあたり500万個の密度で播種します。播種直後の7日目の樹状細胞は、速やかにプレート底面に沈降して接着し、展延し始めます。

Zichyサイトのビデオでご覧いただけるように、このビデオは、7日目に行われた初期の再播種から9日目の初期にかけての樹状細胞の分化を示すため、インキュベーター内で2日間にわたって撮影されました。形態学的に、樹状細胞は抗原パルスによって活性化させることができ、ここでは2 µg/mLのLPSと、ova特異的なCD4陽性T細胞を持つOT-IIマウスから精製したT細胞に使用するための100 µg/mLのovaを添加します。別の抗原を使用する場合は、樹状細胞をパルスさせるために最適な抗原濃度を使用することが重要です。ここで、LPSの最終濃度が20 mL中で2 µg/mLとなり、ovaが20 mL中で100 µg/mLとなるように、ovaとLPSをプライマリ培地に添加します。

これは、培養10日目の樹状細胞の典型的な写真です。この写真から、形態が抗原提示細胞に非常に典型的であることがわかります。常にFACsを用いて、CD 11 C陽性樹状細胞の割合を確認してください。

これは、実験に使用する樹状細胞の培養液が比較的純粋であることを確認するための操作です。ここでは、SEN instruments社のIncyteを用いて、10日目にLPS処理および抗原パルスを行った樹状細胞の活性化をモニタリングします。このビデオは、LPS、val、およびペプチドを添加した直後の24時間を記録したものであり、樹状細胞がより活性化し、明らかな形態学的変化が生じることが示されています。

抗原パルスによって樹状細胞が活性化された後、300 millimolar EDTAでインキュベートし、プレートを洗浄することで、再び細胞を回収できます。次に、細胞を遠心分離して回収し、50 mlsのRPMI培地で2回洗浄して過剰な抗原を除去し、適切なセルトラッカー染料でラベル付けします。本実験では、鼠径リンパ節内の細胞をイメージングします。

ここに示されているマウスの側腹部の真皮内に、200万から500万個の樹状細胞を注入します。その後、樹状細胞がトレーニングリンパ節にホーミングするまで24時間待ちます。このビデオでは、樹状細胞は青色のセルトラッカー染料であるCMF two hcでラベル付けされています。

volinに抗原特異性を持つ、ラベル化されたT細胞と相互作用する樹状細胞を確認できます。これらのT細胞はccf SEでラベル化されています。分子プローブとして、C-M-T-M-Rまたはその他のセルトラッカー染料を使用することも可能です。これは、樹状細胞と相互作用するT細胞の初期活性化段階です。

これらは抗原特異的であるため、T細胞が青色で標識されたDCの突起に付着していることがわかります。以上で、2ボタンイメージング実験におけるマウス由来骨髄樹状細胞の調製および使用法を示すプロトコルを終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。