マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

*C. elegans*は、細胞系譜に関する知見が得られていることに加え、全ゲノムの解読と解析から得られた豊富な情報があるため、極めて有用なモデル生物です。このビデオでは、*C. elegans*へのプラスミドのマイクロインジェクションの手法と、蛍光顕微鏡を用いた形質転換個体の選別について解説します。*C. elegans*は透明な多細胞動物であるため、蛍光ラベル化されたタンパク質を発現する外来遺伝子をin vivoで可視化するのに理想的です。こんにちは、私はローラ・バーコウィッツです。アラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室のリサーチアソシエイトを務めています。

私はアラバマ大学のCalwell研究室に所属するAdam Knightです。本日は、トランスジェニックなC. elegansを作製するためのプラスミンのマイクロインジェクションの準備と実施方法について解説します。また、トランスジェニックなC. elegans系統の選別と維持方法についても説明します。それでは始めましょう。

マイクロインジェクションを開始する前に、いくつかの準備ステップがありますので、ここで説明します。まず、注入するためのプラスミドDNAを準備します。2種類のプラスミドが必要であり、1つは目的遺伝子の組織特異的な発現をコードするもの、もう1つは選択可能な形質転換マーカーを提供するためのものです。これらのプラスミドを、50 nanograms per microliterの濃度で1対1の比率で混合します。

次に、注射時に線虫を固定するために使用するオーガーパッドを準備します。オーガーパッドを作成するには、まず22 by 50 mmのカバーガラスを数枚ベンチトップに並べます。パステールピペットを用いて、1枚のカバーガラスの上に溶解した2% agaroseを1滴滴下し、直ちに2枚目のカバーガラスを1枚目に対して90度の角度で滴の上に重ねます。

エアロゲルを数秒間凝固させた後、上部のカバーガラスを取り除きます。扁平になったエアロゲルのディスクの直径は15〜20 mmである必要があります。その後、パッドを数時間または一晩放置し、完全に自然乾燥させてください。

乾燥後、パッドをカバーグラスボックスに入れ、室温で保存します。次に、DNA溶液用のニードルローダーを準備します。100 µLのキャピラリーチューブを用意し、中央部分を直火で加熱しながら、元の約2倍の長さにまで急速に引き延ばします。

キャピラリチューブが冷却されたら、2つの半分をパキッと折って切り離します。注入用にニードルローダーを10～20本準備してください。マイクロ遠心チューブに立てた状態で保存することができます。

ブラック、注意してください。ニードルローダーの先端は非常に鋭利です。それでは、マイクロインジェクション用の針を作成します。

これらの針は、内部にガラスフィラメントを含む特殊なキャピラリーチューブで作られています。このフィラメントがDNA溶液の芯として機能します。針の作製にはNiki PP eight 30 Polarを使用し、加熱設定を24.8に設定して、保存用に一度に数本の針を引き出します。

複数の針をモデリングクレイのストリップ上に固定することができます。引き伸ばした針の先端を砕くために、カバーガラスの小さな破片を使用します。これらの破片は、18 by 18 mmのカバーガラスをキムワイプで包み、数個の破片に割れるまでゆっくりと圧力をかけて準備します。

サイズが約3×4 mmの破片を使用します。DNAと針の準備に加えて、適切にステージングされた野生型虫を、注入する各発現ベクター構築につき2匹、計50～100匹ほど準備してください。

それでは、マイクロインジェクション顕微鏡のセットアップを行います。まず、マイクロインジェクション針のアームおよびホルダーに接続されているヘリウムタンクのメインバルブを開きます。レギュレーターを閉じて、ガスをラインに導入します。

圧力を35 PSIに設定し、フットペダルを使用してガスを放出させます。次に、標準的な口ピペット用チューブにニードルローダーを挿入し、プラスミド混合液を約1 µL少量滴下します。その後、抵抗を感じるまで、ローダーをマイクロインジェクションニードルの奥までゆっくりと挿入します。

軽く吹き出してからDNA溶液を排出し、ローダーを取り外します。DNAの充填が完了したら、マイクロインジェクションアームにニードルを挿入します。この際、内部の小さなゴム製ガスケット内に配置するように注意し、マニピュレーターのアームにクランプで固定します。次に、カバーガラスの破片（ニードル切断用）をオーガーパッドの端に配置します。

シャードおよびオーガーパッドの全面をハロゲンカーボンオイルで覆います。次に、オーガーパッドを倒立顕微鏡のステージ上に置きます。オーガーパッドを設置した後、Forex対物レンズと明視野照明を用いて、視野の中心にニードルを配置しますが、まだオイルの中まで下ろさないでください。

次に、カバーガラス片の内側のエッジを中央に配置し、そこに焦点を合わせます。針をオイルの中へ下げ、カバーガラス片と同じ焦点面に合わせます。40 x 対物レンズに切り替えて倍率を上げ、再びエッジに焦点を合わせ、必要に応じて針先の位置を調整してください。

次に、注入針の先端を切り開きます。カバーガラスの破片の端に針をそっと押し当てながら、同時にフットペダルでガスを短く噴射します。これで針の先端が十分に切り開かれます。

針先の開口部が大きすぎると、過剰な液流によって小さな液滴が漏れ出します。これは個体を死滅させるため、望ましくありません。針の準備が整ったら、マイクロインジェクションを開始します。次に、針を上に上げて、ステージからオーガーパッドを取り除きます。

ただし、X軸またはY軸の位置は変更しないでください。ステージを針の下から外側にスライドさせます。オーガパッドを取り出し、解剖顕微鏡の上に置きます。

オイルの表面下のパッドに線虫を移します。線虫が激しく動く場合は、オーガーパッドに接触するまで優しく撫でて誘導してください。湿った線虫は乾燥したオーガーに付着します。速やかにオーガーパッドをステージに戻し、線虫を視野の中心に合わせます。

次に、針を線虫と同じ焦点面にまで下げます。倒立顕微鏡のフィルターをホフマン照明に切り替えます。このコントラストフィルターにより、線虫の形態学的詳細を可視化することができます。

40倍の対物レンズを用いて、生殖核のハニカムパターンの下方にある、虫の生殖腺の粒状の感覚中心に焦点を合わせます。針に面した側に位置する生殖腺を選択してください。針の先端にも焦点が合うまで、針の位置を微調整します。

針を生殖腺の中心にゆっくりと挿入し、短時間ガス圧をかけて、DNAを1、2滴生殖腺腕の中に注入します。十分な練習と熟練により、液体が遠位生殖腺に広がっていく波が観察できるようになります。これにより、毎回確実に生殖腺の中心に注入することが可能です。

蠕虫に注入を行う際は、迅速に作業することが重要である点に留意してください。これは、個体が容易に乾燥してしまうためです。全工程は、理想的に1〜2分以内に完了させる必要があります。

注入が完了したら、オーガーパッドをステージから取り外し、解剖顕微鏡の上に置きます。注入した線虫にM9バッファーを1 µL直接滴下します。この際、ピペットのチップをハロカーボオイルの表面下に浸す必要があります。

バッファーによって線虫が再水和され、エアロパッドの表面から浮き上がります。ワームピックを使用して、線虫を通常のプレートに移してください。ここからは、注入済みの線虫をAdamに引き継ぎ、形質転換系統の選別と維持について説明してもらいます。注入済みの線虫は、それぞれ新しく播種した60 mmプレートに個別に移され、繁殖させます。

これらの虫はP0世代に相当します。通常、注射した個体は、子が現れるまで20 °Cで2〜3日間インキュベートします。子が現れた時点で、トランスジェニック虫のスクリーニングを開始できます。

F1世代の個体について、導入遺伝子のマーカーを確認します。本例では、選択マーカーとして蛍光マーカーを使用しているため、蛍光実体顕微鏡を用いてスクリーニングを行います。蛍光を持つ各F1個体を、それぞれ別のプレートに分離してクローニングします。

注入されたP0世代からは、F1世代全体の中で1匹から5匹の蛍光を発する子孫が得られるのみである可能性があります。F1世代の雌雄同体に20°Cで2〜3日間繁殖させ、子孫が現れるまで待ちます。F2世代が準備できたら、同様にトランスジェニック動物の有無を観察します。トランスジェニックマーカーを継承し、発現しているF2世代の個体は、安定した系統であると見なされます。

各独立した安定系統は個別の系統として維持してください。世代ごとに数匹の形質転換個体を新しいプレートに移植することで、各系統を増殖させます。この操作は必ず蛍光立体顕微鏡を用いて行ってください。選択マーカーが蛍光性である場合、遺伝子コピー数のばらつきを制御するため、注入したコンストラクトあたり最低3つの独立した安定系統を構築してください。

以上で、発現ベクター構築物のマイクロインジェクション方法、および安定発現株の選抜方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。