セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

こんにちは、MIT生物学科のSusan Linus研究室の大学院生、Randall Hoffmanです。今日は、半変性界面活性剤アガロースゲル電気泳動（SDD-AGE）についてご紹介します。私たちの研究室では、プリオンやその他のアミロイド原性タンパク質のスクリーニングにこの手法を用いています。

当社のSDD ageの手法はシンプルで信頼性が高く、任意のサンプル数に合わせてスケールアップすることが可能です。アミロイドはSDSによる変性に極めて強い耐性を持つため、SDDHを用いることで他のタンパク質から分離できます。しかし、SDDHから得られたデータのみで、ある物質がアミロイドであると断定することはできません。

そのためには、別の手法を用いる必要があります。それを踏まえて、実演いたします。S-D-D-H-S-D-D-Hは、標準的な水平DNA電気泳動装置を用いて実施可能です。

まず、ゲルキャスティングトレーを組み立てます。装置のサイズは、サンプルの数によって異なります。サンプル数が多い場合は、20 by 24 cmのスラブと、最大4本の50ウェルコームを使用します。

ゲルの調製には、中または高強度の低EEOアガロース、1×TAEバッファー、および10% SDSストック溶液が必要です。1.5% アガロース溶液と1×TAEを調製します。多くのサンプルをロードし、検出を最大化するために、ゲルはできるだけ厚く作ってください。アガロースが完全に溶解するまで、混合物を電子レンジで加熱します。

100 XSDSストック溶液を0.1%に迅速に添加し、旋回させて混ぜ合わせます。このステップで一部が凝固した場合は、ホットプレートで溶解させてください。沸騰させないよう注意してください。

SDSを添加すると溶液が容易に泡立ってしまうため、熱いうちにこの溶液をキャスティングトレイに注ぎます。次に、後のゲル転写時に妨げとなる可能性のある気泡を、コームを用いて取り除きます。ゲルが完全に冷却され固化した後、慎重にコームを取り外し、ゲルをタンクに設置します。

ゲルを0.1% SDSを含む1× XTAEに完全に浸します。これでサンプルのロード準備が整いました。SDDHで使用するタンパク質サンプルは、2つの重要な例外を除いて、SDS-PAGEと同様に調製します。

第一に、凝集塊がタンパク質モノマーに脱凝集する可能性があるため、サンプルの加熱は避けてください。第二に、タンパク質の分解を防ぐよう注意してください。本手法で用いる変性条件ではすべてのプロテアーゼを不活化させるには不十分であるため、推奨濃度の少なくとも2倍の完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用することを推奨します。

本デモンストレーションでは、目的の特定のタンパク質を過剰発現させた酵母細胞のライセートを使用します。通常は、VWRから入手可能な96ウェルブロックを用い、2 mLの培養液で一晩培養します。ただし、低発現タンパク質を分析する場合は、より大きな培養量を使用する必要があります。

培養液を室温で 2000 RCF で5分間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、上清を除去し、水を加えて再懸濁し、再度遠心分離して細胞を洗浄します。2回目の遠心分離後、上清を除去し、細胞を少量のプレート用溶液に再懸濁します。溶液中の酵素が細胞壁を消化するため、少量の溶解バッファーで効率的に細胞を溶解させることができます。30 °C で30分間インキュベートします。

予備のプラスチック細胞を、今回は800 RCFで5分間遠心してペレット化します。上清を完全に除き、各ペレットを100 µLの溶解バッファーで再懸濁します。次に、ブロックをテープで覆い、高速で2分間ボルテックスします。

これにより、4,000 RCFで2分間遠心分離し、すべてのプラスチックスフィアから細胞残渣を分離させます。その後、上清を慎重に96ウェルPCRプレートに移します。

通常、当研究室では一度に数百個のサンプルを分析するため、液体ハンドリングシステムを用いて作業を効率化しています。必要に応じて、ライセートのタンパク質濃度を測定してください。次に、サンプルに4xサンプルバッファーを添加して1xサンプルバッファー濃度のライセートを作成し、室温で5分間インキュベートします。

次に、サンプルをゲルにロードします。必要に応じて、サンプルの半分をSDS-PAGE解析用に保存しておきます。また、プレステインマーカーや、ニワトリのflector s抽出液のような超高分子量マーカーを含む分子量マーカーをロードします。

必要に応じて、低分子量タンパク質の拡散を防ぐためにゲルを冷却することが重要であるため、低温室で電気泳動を行うことが推奨されます。ゲルの長さ1cmあたり3V未満の低電圧で泳動させてください。色素がゲルの末端から約1cmの位置に達するまで、数時間泳動します。

アミロイドは室温の2%SDSでは変性しないため、2%SDSの存在下でほとんどの非アミロイド凝集体を含む他の複合体が解離しても、アミロイドはそのままの状態を維持します。したがって、ほとんどのタンパク質は単量体となり、ゲル内を速く移動します。一方で、SDS耐性を持つ高分子量アミロイドの移動速度はより遅くなります。

これで、ゲルの転写準備が整いました。転写方法には複数の手法がありますが、毛細管転写を用いることで最良の結果が得られます。毛細管転写はあらゆるサイズのゲルに対応できるため、数百ものサンプルを分析する場合に実用的です。

乾燥したブロッティングペーパーを重ねることで、緩衝液をゲルから吸い上げ、ペーパーとゲルの間に配置したニトロセルロース膜にタンパク質を転写させます。High Bond C Extraなどのニトロセルロースを、ゲルと同じ寸法に切り出してください。また、GBO 04ブロッティングペーパーを20枚、GBO 02ブロッティングペーパーを8枚、それぞれゲルと同じサイズに切り出しておく必要があります。

GB 04は非常に厚く、吸収性に優れています。一方、GB 02はそれよりもずっと薄く、きめの細かい質感であるため、メンブレンとより均一に接触させることができます。芯として使用するためのGB 04を別途切り出し、浸漬させたゲルの幅よりも約20 cm広くしてください。

プラスチック容器に、ニトロスUL WIC、GBO O₂ 4枚、およびXTBS 1枚を用意し、以下のようにフィルターを積層させます。まず、乾燥したGBO O₄を20枚重ねます。次に、乾燥したGBO O₂を4枚重ねます。最後に、あらかじめ濡らしておいたGBO O₂を1枚重ねます。

このスタックの上にニトロセルロース膜を載せます。キャスティングトレー上のゲルを水で軽くすすぎ、余分なランニングバッファーを取り除きます。その後、必要に応じてTBSで膜を濡らしながら、ゲルをトレーから慎重に滑らせてスタックの上に移動させます。

バッファーを多めに加えることで、ゲル内に気泡が閉じ込められるのを防ぐことができます。ゲルを完全にスタッキングゲル側に移動させた後、転送ピペットを使用するとこの操作に有効です。気泡が残っていないか十分に確認してください。

ゲルの端を持ち上げ、気泡が抜けるまでバッファーを再度加えます。あらかじめ濡らしておいた残りの3枚のGBOoh 2片をゲルの上に載せます。ピペットでスタックの上部をしっかりと転がし、すべての層が完全に密着していることを確認してください。

転写スタックの両脇にTBSを入れた2つの高さのあるトレイを配置し、あらかじめ濡らしたウィックをスタックにわたらせて、ウィックの両端がTBSに浸かるようにします。組み立てた転写スタックの上に、500 mLの水が入ったボトルなどの重りを載せたプラスチックトレイをさらに被せます。これにより、ウィックがトレイからバッファーを吸収し、乾燥したブロッティングペーパーが数時間かけてゲル内にバッファーを吸い上げます。

これにより、タンパク質がメンブレン上に沈着します。転写を最低3時間、または一晩行わせてください。キャピラリー転写の完了後、メンブレンを標準的なウェスタンブロッティングの手順で処理できます。ここでは、特定のタンパク質がアミロイドを形成しやすい酵母株において過剰発現させたタンパク質の代表的なブロットを示します。

ここで示しているものやこちらに示しているもののように、一部の候補物質はアミロイドまたは高分子量のSDS耐性種を非常に良好に形成していることが明確にわかります。一方で、これらやこれらのように、凝集体を形成せず完全に単量体であるものもあります。さらに、これら2つのレーンでわかるように、アミロイドポリマーのサイズはタンパク質によって異なることが見て取れます。

プリオン候補物質のアミロイドなどの、高分子量で不溶性の凝集体を分析するための簡単な方法をご紹介しました。本プレゼンテーションがお役に立ち、免疫原性タンパク質の研究においてこの手法をご活用いただければ幸いです。ご視聴ありがとうございました。皆様の研究の成功をお祈りいたします。