人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

ヒト脳におけるニューロン特異的な遺伝子発現を制御するクロマチンDNA相互作用を研究するためには, まずニューロン核の純粋な集団を得る必要があります。死後ヒト脳組織をホモジナイズし, 密度勾配遠心法を用いて全核を単離します。次に, ニューロン特異的抗体で核を標識し, フローサイトメトリーによるソーティングで分離した後, 最終的に超遠心分離法で濃縮します。

こんにちは。マサチューセッツ大学医学部精神科のSharon mc Barian博士の研究室に所属しているAnish Matanです。本日は、死後ヒト脳組織から神経細胞核を単離する手順について説明します。それでは始めましょう。

ソートする各核サンプルについて、1,000 mgの凍結死後脳組織から開始します。この量から、蛍光活性化細胞分取（FACS）後に約500万個のニューロン核を得ることができます。核抽出を開始するには、250 mgの脳組織を5 mLの溶解バッファーを含むダウンチューブに入れ、氷上に置きます。

組織を解凍後、氷上で1分間ダウンサイジングします。ダウンサイジング後、ホモジナイズした組織を15 mLの透明超遠心管に移し、チューブを氷上に置きます。残りの組織についても、このホモジナイズ操作を繰り返します。

次に、ホモジナイズした組織溶液がショ糖溶液の上に載るように濃度勾配を作るため、ショ糖溶液9 mLを carefully に超遠心管の底へピペッティングします。次に、超遠心分離中にバランスが保たれるよう、超遠心管の重量を測定します。重量の調整が必要な場合は、最上層に溶解バッファーを添加して調整してください。重量測定後、SW 28ローターを用いて超遠心機にセットし、4°C、107,163.6 RCFで2.5時間、超遠心分離を行います。

遠心分離が完了したら、上清と濃度勾配に形成されたデブリ層を吸引して除去します。チューブ底部にある核を含むペレットを乱さないように注意してください。次に、各ペレットに500 µLの1X PBSを加え、氷上で20分間静置します。

20分後、ピペッティングによってペレットを再懸濁します。氷上でのインキュベーションにより、ペレットが自然にわずかに溶解するため、核をより容易に再懸濁でき、核へのストレスを軽減できます。その後、再懸濁した核を2 mL centrifuge tubesに移します。

2本の超遠心管から得られた核酸溶液を、それぞれマイクロ遠心チューブにまとめ、再度サンプルを氷上に置きます。核酸抽出が完了したため、次に、FACSソートにより神経細胞核を分離するための免疫染色ステップに移ります。核を含むサンプルを、一次抗体と二次抗体、およびブロッキング剤からなる免疫染色混合液とともにインキュベートします。免疫染色混合液を調製するには、1.2 µLの神経細胞特異的抗体NeuNを300 µLの1x PBSに加えます。次に、0.5% BSAおよび10%正常山羊血清を含む1x PBSのブロッキングミックスを100 µL加えます。

最後に、LOR 4 88と呼ばれる二次抗体を1 µL添加します。また、この免疫染色の混合液を用いて、陰性対照サンプルのための免疫染色を準備します。一次抗体を除き、代わりに1X PBSを1.2 µL加えます。

次に、免疫染色の混合液をボルテックスし、染色混合液のインキュベーション中、室温かつ暗所で5分間インキュベートします。陰性コントロールサンプル用にコントロール核サンプルを調製します。1 XPBS 980 µLを含む2 mLチューブに、再懸濁した核を20 µL分量、分注します。また、核溶液とPBSのみを含む未染色コントロールも調製します。

次に、核懸濁液 20 µL を別のチューブに分注し、1×PBS で液量を 1 mL に戻します。その後、すべてのサンプルを再び氷上に置きます。これで、免疫染色混合液の調製が完了しました。

適切に分注したサンプルに、混合液を401 µLずつ加えます。核サンプルの試料には、newおよびLOR 4 88の両方を含む混合液を加えました。陰性コントロールサンプルには、二次抗体であるLOR 4 88のみを含む混合液を加え、無染色コントロールサンプルには免疫染色の添加を行いませんでした。

次に、サンプルをコールドロンに移し、暗所で45分間回転させます。45分間のインキュベーションが完了しましたので、サンプルをマサチューセッツ大学医学部のフローサイトメトリー・コアファシリティに運び、蛍光活性化細胞分取（FACS）を行います。コアファシリティへの運搬中、サンプルは氷上で遮光状態で保持してください。フローサイトメトリー・コアファシリティでは、まずサンプルを40 µmのフィルターでろ過し、その後、低温を維持しながら数分間装置にかけます。

これは、ソーティングを行う前に予備データを取得するために行います。未染色のコントロールによって、ネガティブ蛍光の程度を決定します。この情報に基づいて、装置の蛍光感度を調整してください。

染色コントロールは、蛍光のコントロールに使用されます。この時点で蛍光によるバックグラウンドノイズを確認し、ソートに必要な適切なゲートを設定します。サンプルのソートには、いくつかの異なるゲートが使用されます。

以下は、最初のゲートに関する典型的なデータです。このfax解析チャートは、ゲート調整後の代表的なサンプルを示しています。最初のゲートでは、蛍光などの設定と一般的な視覚的経験を組み合わせて、デブリと生存核のパターンを認識します。

x軸は前方散乱光を表し、これは相対的な大きさに対応します。一方、y軸は側方散乱光であり、顆粒度などの内部複雑性を表します。最初のゲートにより、サンプル内で検出された異なる核のサイズを把握することも可能です。これにより、デブリと実際の核を分離でき、ここでは2番目のゲートから得られた代表的なデータを提示します。

このファックスチャートは、凝集物を排除しながら核を個別にソートすることを可能にする、2番目のゲートの例を示しています。このゲートでは、核がレーザーを通過するのにかかる時間の差を解析します。通常、凝集物は通過に時間がかかります。

凝集塊が含まれていると、一部の蛍光核が非蛍光核と結合している可能性があり、純度に影響を及ぼすため、このパラメータは非常に重要です。最後に、3番目のゲートから得られた典型的なデータを示します。このゲートは、二次抗体に含まれるフルオロフォアの蛍光波長に合わせて設定されています。

このファクチャートでは、X軸に蛍光レベル、Y軸にディープレッドチャンネル検出器のPECy7が表示されています。これらのドットプロットは、単色のヒストグラムと比較して、より優れた視覚的判断を可能にします。SCADAを用いることで、ニューロン陽性核をニューロン陰性の非ニューロン核からソートして分離させることができます。

すべてのゲートを選択した後、核を1つのXPBSにソートします。サンプル全体がソートされた後、ソート済みサンプルのEloquaを装置で走らせて、ソートの純度を確認します。以下に最適結果の例を示します。

ここでは、核の混合集団を含むソート前のサンプルと、陰性核の大部分が除去されたソート後のEloquaを比較します。純度の割合は、設定されたゲートに基づき、サンプルに混入しているイベント数に基づいていることに注意してください。また、サンプルを最初に装置に通した際に、一部で退色が生じ、輝度が低下することがあります。これを考慮し、いくつかの調整が必要になる場合があることを念頭に置いてください。

サンプルのソートが完了したら、核の処理を開始します。まず、ソート済みサンプルを10 µL取り、2 µLのスクロース溶液、50 µLの1 M塩化カルシウム、および30 µLの1 M酢酸マグネシウムを加えます。ソート済みサンプルが10 µLに満たない場合は、1x PBSを加えて10 µLまで増量させるか、あるいは添加量を適宜調整してください。

次に、サンプルを数回転倒混和し、氷上で15分間静置します。15分後、スイングバケットローターを用いて、4°C、1,786 RCFで15分間遠心分離します。遠心分離後、チューブ底部の白いペレットを乱さないように、上清を慎重に吸引除去します。

次に、前の実験で必要だった適切な溶液200 µLでペレットを溶解させます。今回は、後続のチップ実験のために、ペレットを溶解バッファーで溶解しています。その後、ピペッティングによってペレットを再懸濁させます。

この時点で、核をより小さなチューブに移し、-80 °Cのフリーザーに保管することができます。これで、ヒトの死後脳組織から神経細胞核を単離する方法について説明しました。これらの核を用いて、クロマチン免疫沈降などのさまざまな解析を行うことが可能です。

この手順を行う際は、核が固定されておらず高温で分解する可能性があるため、サンプルを常に氷上に保持することが重要です。また、ヒト組織はバイオセーフティレベル2以上の安全基準に従って取り扱う必要があります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。