CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング

私はMariaで、スウェーデンのNOSにあるY Healthcareで研究を行っています。細胞表面タンパク質は、細胞と周囲の環境とのコミュニケーションに深く関与していることが多いため、疾患への理解を深めるだけでなく、細胞環境の変化によって引き起こされるその他の生物学的変動を解明することを目的とした研究において、特に重要視されています。このビデオでは、シンプルなサイドアイ・ドッジ細胞表面標識プロトコルをご紹介します。これにより、物理的な濃縮を行うことなく、低発現のタンパク質を視覚的に濃縮し、この技術を用いてそれら細胞表面タンパク質の差異を解析することが可能になります。

この技術に興味がある場合は、2Dハンドブックでより詳細な情報を確認できます。さらに、この特定のトピックに関するアプリケーションノートをjobからダウンロードいただけます。上記の細胞表面標識プロトコルでは、細胞をそのままの状態で標識します。標識プロセスにおいて、染料は細胞表面タンパク質にのみアクセスします。

ラベル化ステップの後、細胞表面特異的なラベル化を確認するために細胞を解析します。ラベル化サンプルを膜タンパク質と細胞質タンパク質に分画しました。並行して、分画していないサンプルも調製しました。

比較のため、この分画解析は必須ではありませんが、ここでは細胞表面プロトコルが細胞表面タンパク質に特異的であることを示すために実施しました。また、以下に示す標準的なETH非食事制限標識プロトコルも実施しました。この方法では、標識前に細胞を溶解させるため、すべての細胞内タンパク質が標識可能となります。標識ステップの後、サンプルは2次元電気泳動に供されます。

標的となる細胞表面タンパク質の消化を避けるため、非酵素的な手法を用いて接着細胞を剥離させます。本プロトコルではラバーポリスマンを使用しますが、Enzyme-Free Cell Dissociation Mediumを使用することも可能です。細胞懸濁液をカウントし、1本あたり500万から1000万個の細胞になるように分注します。その後、細胞を遠心してペレット化し、細胞培養液の痕跡を除去するためにH-P-S-S-P-H 7.4で洗浄します。

血清タンパク質や蛍光成分による培地の汚染は、標識および検出の妨げとなる可能性があります。浮遊状態で増殖している細胞は、標識ステップの前の洗浄工程で直接ペレット化し、洗浄します。細胞ペレットを、HPSS pH 8.5および1 molar uriaを含む200 microlitersの氷冷標識バッファーで再懸濁します。

細胞表面タンパク質の最適な標識条件を得るためには、常にpHを確認してください。標識に際し、1,000万個のCHO細胞に対して600 pic molのside-eyeを使用しました。side-eyeと細胞数の最適比は、細胞型によって異なります。

細胞表面の正確なタンパク質濃度は不明であるため、タンパク質のサイドチェーン標識に最適な条件を決定する方法については、「2D electrophoresis principles and methods handbook」に記載されています。細胞をサイドチェーン標識用ダイスと共に、氷上の暗所で20分間インキュベートします。

標識反応後、10 millimolarのリシンを20 µL添加して未反応の色素をクエンチします。次に、標識した細胞を冷えたHPSS pH 7.4バッファーで2回洗浄し、過剰な色素を除去します。これにより、次のステップである細胞溶解において、不要な細胞内標識やタンパク質への標識を引き起こす遊離色素が残らないようにします。

細胞表面のタンパク質が標識され、細胞の洗浄が完了し、溶解可能な状態になりました。最後の洗浄ステップで得られたペレットを、7 M urea、2 M thiourea、4% CHAPS、30 mM Tris、5 mM 酢酸マグネシウム（pH 8.5）を含む150 µL の冷溶解バッファーに再懸濁し、時折ボルテックスミキシングを行いながら、氷上で少なくとも1時間静置します。これでサンプルは2D分離が可能な状態になります。

電気泳動の最初のステップは、再水和用のIPGストリップを準備することです。使用するストリップのpH範囲に応じたIPG緩衝液を加え、再水和溶液を調製し、その溶液を再水和トレイの槽に入れます。IPGストリップの保護フィルムを取り除き、乾燥したゲル面を下にして、再水和溶液の入った再水和トレイに慎重に配置します。

IPGボックスの蓋を閉じ、ストリップを一晩再水和させます。第一次元である等電点電気泳動では、タンパク質がそのpIに基づいて分離されます。これはIPG 4/10を用いて行われます。

再水和させたストリップをマニホールドに配置し、電極を上部に装着します。サンプル適用キャップを用いて、各サンプルから 50 micrograms を適用しました。分画前の非分画サンプルを直接適用するか、あるいはサンプルを膜画分と細胞質画分に分画してから適用しました。

蛍光サンプルを光から保護するため、リードを閉じます。機器を推奨設定に従ってプログラムし、一晩走らせました。大きな12%のlambyゲルを、成体用12ゲルを用いて作製しました。

チューブ内でのアクリルアミドゲルの重合を防ぐため、コスター置換溶液を添加しました。ゲルは使用前に室温で一晩重合させました。等電点電気泳動の後、ストリップを取り出し、2段階のステップでSDS含有バッファーを用いて平衡化させました。まずDTTを用いてシステイン残基のジスルフィド結合を還元し、次にアクリルアミドによる修飾を防ぐため、ヨードアセトアミドを用いてアルキル化を行いました。

IPGストリップをランニングバッファーに浸し、2次元ゲルの上部に慎重に配置します。ストリップとゲルの間に気泡が入らないよう、ブロモフェノールブルーを含む融解した2%アガロース溶液を上から加えます。これで、2次元目のSDS-PAGE分離の準備が整いました。

タンパク質は分子量に基づいて分離され、これはtonal sixシステムを用いて行われます。電気泳動槽にアノード走行バッファーを満たし、ゲルを挿入して、上部コンパートメントにカソード走行バッファーを満たします。推奨に従って電源を設定し、遮光状態で2次元電気泳動を約4〜5時間、または色素前線がゲルの下端に到達するまで実施します。

2次元電気泳動後、グリッパーを用いてゲルカセットをTyphoon蛍光イメージャーに設置します。2枚のゲルと3つのチャンネルを同時にスキャンすることが可能です。この2次元電気泳動（2-DL）の結果は、疎水性タンパク質が2-DLで検出されにくいという既知の制限があるものの、サンプル中の膜タンパク質の高い分解能を示しています。結果からは、標準的なラベル化プロトコル（緑色で表示）では検出されなかった、多くの新しい細胞表面ラベルスポット（赤色で表示）が確認できます。

この結果は、細胞表面標識プロトコルが細胞表面タンパク質の標識に対して非常に特異的であることを示しています。細胞表面タンパク質のみが標識されるため、可視化が容易になり、豊富に存在する細胞質タンパク質による減衰を避けることができます。上図には、分画されていない膜画分または細胞質画分を含むゲルの蛍光画像が示されています。

以下は、同じゲルを銀染色した後の画像です。結果から、細胞質タンパク質の蛍光標識は認められませんが、銀染色によりゲル中にタンパク質が存在することが示されています。また、非分画画分と膜画分で同様のスポットマップパターンが得られたことから、2D電気泳動の前に分画を行う必要がないことが示されており、本プロトコルを簡便かつ効率的なものにしています。

SI two、SI three、およびSCI fiveは同様の標識パターンを示し、いずれも細胞表面プロトコルに適合しています。血清飢餓状態の異なる時間のCHO細胞における細胞表面タンパク質の差分発現を研究するため、3種類のside eye DI floor minimal dyすべてを用いて食事実験が行われました。実験内のすべてのサンプルから得られたCY two細胞表面サンプルをプールし、内部標準として使用しました。

飢餓期間中におけるいくつかの細胞表面タンパク質の変動を追跡することができました。細胞表面プロトコルを用いることで、調製用ゲルのタンパク質同定における標準プロトコルでは検出されなかった18種類以上の新規膜タンパク質が検出されました。分析データセット上のスポットへの照合を容易にするため、細胞表面サンプルをスパイクすることが必要でした。

結果は以下の通りです。結果から、多数の細胞表面タンパク質が高解像度で検出されていることがわかります。このプロトコルは細胞表面タンパク質に対して非常に特異性が高く、細胞内タンパク質の標識は認められませんでした。

この手法を用いることで、標準的なプロトコルと比較してより多くの細胞表面タンパク質を検出することができ、またすでにご覧いただいた通り、非常に簡便に実施できるプロトコルです。細胞表面タンパク質がそのままの状態でラベル化し、膜分画を行うことなく直接2次元電気泳動に供します。したがって、本プロトコルは細胞表面タンパク質の研究および、D技術を用いたそれらの差異を検討する上で非常に有効です。