大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック

まず、マウスを麻酔し、手術部位の準備を行います。次に、マウスを脳定位固定装置の上に腹臥位で配置します。後頭骨の下方で皮膚を正中方向に切開し、皮下組織と頚筋を正中線に沿って鈍的に剥離します。

次に、固定した頭部に対して身体が135度の角度になるように体の後部を倒し、大後頭孔の硬膜をガラスキャピラリーで貫通させ、CSFを採取します。CSFのサンプリング後、筋肉を整えて皮膚を縫合し、脱水を防ぐために0.9% NaCl生理食塩水を約1 mL皮下注射し、マウスが回復するまで保温します。こんにちは、コロンビア大学The Top InstituteのDr. Karen Duffの研究室のLiuです。

本日は、マウスのcisterna magna（大槽）から脳脊髄液を採取する方法をご紹介します。この手法を用いることで、同一のマウスから2〜3ヶ月の間隔で最大3回まで、連続的にCSFサンプルを採取することが可能です。当研究室では、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルを用いて、異なる年齢におけるCSF中のAβまたはtauレベルを測定し、それらの値を脳内の値と相関させるためにこの手法を利用しています。

最後に、疾患の進行およびマウスを用いた治療試験における潜在的なバイオマーカーとして、CSFAのβまたはtauレベルの可能性について検討します。それでは、始めていきましょう。この手順では、マイクロピペットプルアーを用いてキャピラリーを作製する必要があります。

本手法で使用するキャピラリーは、Sutter Instruments社製のBOAケイ酸ガラスB 175 10であり、Sutter P 87火炎マイクロピペットプラーを用いて、加熱指数を300、圧力指数を330に設定して作成します。ガラスキャピラリーの長さは5 cmで、先端はテーパー状になっています。キャピラリーの先端をハサミでカットし、内径を約0.5 mmに調整します。

外科的手順は、ケタミン 100 mg/kg およびキシラジン 10 mg/kg を腹腔内投与してマウスを麻酔することから始めます。麻酔中は、マウスを 37 °C のインキュベーター内で保温してください。足指つまみによる逃避反射で動物が完全に麻酔されたことを確認した後、頸部を剃毛し、David Kink 社製などの脳定位固定装置にマウスを設置します。 heating pad に直接接触するように直腸温度プローブを挿入し、マウスの体温に応じてパッドの熱量を調整できるようにします。

ヘッドアダプターで頭部を固定し、頸部の皮膚を10%ポビドンヨードと70%エタノールで3回拭き、後頭部または後頭骨の下方から正中切開を行います。以降の手順は、解剖顕微鏡下で鈍端ピンセットを用いて実施してください。皮下組織および筋肉（M ventor servicesおよびM rectus capita dorsalis major）を剥離し、大後頭神経の硬膜を露出させます。マイクロリトラクターを用いて、筋肉を適切に保持して広げてください。

最後に、マウスを頭部が体に対して135度の角度になるように置きます。これで、CSF採取の準備が整いました。この大槽（cisterna magna）からCSFを採取する手法は、以前に報告されています。

解剖顕微鏡下での図1 A。硬膜は光沢のある透明な逆三角形として現れ、その向こうに延髄と主要な血管が見える。dural spinella（硬膜脊髄動脈）図1 B。延髄および隣接するCSF空間の循環拍動が観察できる。

滅菌綿棒で硬膜を拭いて乾燥させ、arteria dorsalis spinelsの外側から硬膜を貫通して、毛細管をcisterna magnaに挿入します。毛細管が正しく挿入されると抵抗感に明らかな変化があり、その後CSFが毛細管内に流入します。CSFを採取した後、注意深く毛細管を抜き、内径1 mmのポリエチレンチューブを用いて3 mLシリンジに接続します。

CSFを0.5 mLチューブに分注します。チューブにラベルを貼り、直ちにドライアイスで凍結させます。凍結後、CSFを-80 °Cのフリーザーに移します。

たった今実演したサンプリング手法は非常に低負荷であるため、2〜3ヶ月の間隔を空けて同一のマウスから継続的にCSFサンプルを採取することが可能です。したがって、サンプリング後は、頸部の筋肉と皮膚を元の位置に戻し、縫合して閉じます。切開部を縫合した後、マウスを再水和させるため、0.9%NACL生理食塩水を約1 mL皮下注射してください。

マウスが回復するまで、約37 °Cで保温してください。術後1日目と7日目に体重を測定します。以上で、マウスのシステムバッグから脳脊髄液を採取する方法を説明しました。

この手順を行う際、留意すべき重要な点が3つあります。第一に、Cy Magnaのatorを可能な限り露出させるため、マウスの頭部と身体を定位固定装置上に適切に配置してください。第二に、キャピラリーでデュロメーターを貫通させる際は、血管を慎重に避けてください。

そうしないと、サンプルが血液で汚染されてしまいます。最後に、低体温症を防ぐため、処置中は常にマウスを保温することを忘れないでください。低体温症はマウスに有害であるだけでなく、β-カテニン産生やTLR4の低リン酸化を誘発し、結果に大きな影響を及ぼす可能性があります。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。