공간 전사체 데이터 분석을 위한 실무 워크플로우: 데이터 획득부터 심층 분석까지

요약

본 프로토콜은 공간 전사체 데이터 분석을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제시하며, 공개 데이터 획득 및 Seurat 기반의 품질 관리부터 통합, 공간적 특징 검출, 세포 유형 디콘볼루션(deconvolution), 관심 영역 주석 달기, 그리고 세포 간 통신 분석에 이르기까지의 과정을 안내하며, 투명한 실행을 지원하는 실질적인 체크포인트를 제공합니다.

초록

공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 mRNA 분자의 2차원적 공간 문맥을 유지하면서 전유전체 수준의 유전자 발현을 프로파일링하여, 조직 구조 및 미세환경 관련 생물학 연구를 가능하게 합니다. 그러나 데이터 가져오기, 품질 관리, 통합, 디콘볼루션(deconvolution), 공간 통계 및 시각화 과정에서 종종 여러 소프트웨어 환경과 재현 가능한 파라미터 선택이 필요하기 때문에 ST 분석은 여전히 까다로운 과제로 남아 있습니다. 본 프로토콜은 R을 이용한 공개 ST 데이터셋의 실용적인 계산 워크플로우를 제시하며, 데이터 획득 및 소프트웨어 설정부터 시작하여 Seurat 기반의 데이터 로딩, 품질 관리, 정규화, 다중 샘플 통합, 클러스터링 및 공간 가변 유전자 분석으로 이어집니다. 이후 워크플로우는 참조 가이드형 SPOTlight 분석 및 비지도 학습 기반 STdeconvolve 토픽 모델링을 포함한 상호 보완적인 디콘볼루션 전략을 적용하며, 이어서 Giotto 기반의 공간적 세포 간 통신 분석과 맞춤형 Python Dash 애플리케이션을 이용한 인터랙티브 관심 영역(ROI) 선택을 수행합니다. 스크립트 기반 실행, 명시적인 파라미터 근거, 예상 결과 및 문제 해결 체크포인트를 강조함으로써, 본 프로토콜은 데이터셋 및 플랫폼별 파라미터 평가 후 표준 어레이 기반 ST 데이터셋 및 관련 플랫폼에 적용 가능한 유연한 프레임워크를 제공합니다.

서론

공간 전사체학(Spatial transcriptomics, ST)은 조직 절편 내 메신저 RNA(mRNA) 분자의 공간적 좌표를 유지하면서 게놈 전반의 유전자 발현을 측정하는 혁신적인 기술군입니다. ST 방법에는 위치 바코드가 지정된 어레이를 사용하는 시퀀싱 기반 접근법과 온전한 조직 미세환경 내에서 전사 신호를 매핑하는 in situ 이미징 접근법이 포함됩니다^1,2. ST는 공간적 맥락을 보존함으로써, 조직 해리 후에는 완전히 분석할 수 없는 조직 구조, 세포 인접 조직 구성, 세포 간 통신 및 미세환경 관련 생물학적 과정의 분석을 가능하게 합니다³.

공공 ST 데이터 저장소의 급격한 성장은 2차 분석 및 방법론 개발에 전례 없는 기회를 제공해 왔습니다³. CROST 데이터베이스와 같은 리소스는 다양한 종과 기술 플랫폼에 걸쳐 수백 개의 공간 분해 전사체 데이터셋을 큐레이션하며, STOmicsDB와 같은 전문 컬렉션은 Stereo-seq와 같은 특정 방법론에 집중합니다^4,5. 이러한 데이터의 풍부함에도 불구하고, 공간 데이터 구조의 복잡성, 분석 도구의 다양성, 그리고 재현 가능한 워크플로 구현의 기술적 장애물로 인해 계산 분석은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다^{6,7,8,9,10,11}.

단일 소프트웨어 환경에 의존하는 한계를 해결하기 위해, 상호 보완적인 분석 도구를 활용하는 통합 계산 워크플로우를 본 논문에서 제시한다. 기존의 종합적인 ST 분석 생태계에는 주로 Seurat, Giotto 및 Squidpy^6,7,12와 같은 Python 기반 프레임워크가 포함된다. Squidpy와 같은 Python 기반 도구는 공간 그래프 분석을 위한 광범위한 기능을 제공하지만, 주요 계산 파이프라인을 단일 프로그래밍 언어 환경 내로 통합하면 언어 간의 기술적 장벽을 최소화할 수 있다. 따라서 언어 간 기술적 장벽을 줄이기 위해 핵심 파이프라인은 주로 R로 구현되었다. 이 R 기반 워크플로우 내에서 Seurat은 데이터 로딩, 품질 관리, 정규화, 차원 축소, 시각화 및 다중 샘플 통합에 사용되며, 이는 단일 세포 및 공간 전사체 워크플로우에서 Seurat이 보편적으로 사용되는 것을 반영한다. 이후 Giotto는 공간 네트워크 구축 및 리간드-수용체 기반의 세포 간 통신 분석에 사용된다. 결과적으로 이 파이프라인은 Seurat 기반의 전처리와 통합을 Giotto 기반의 공간 분석과 연결하며, 두 도구 세트 간의 데이터 전송을 명시적이고 재현 가능하게 유지한다.

이 프레임워크 내에서는 두 가지 상호 보완적인 디컨볼루션(deconvolution) 전략이 구현되어 있습니다. 하나는 scRNA-seq 데이터를 사용하여 세포 유형 비율을 추정하는 참조 가이드 방식인 SPOTlight이며, 다른 하나는 잠재적인 전사 패턴을 식별하는 비지도 학습 기반의 토픽 모델링 방식인 STdeconvolve^8,11입니다. 출력 결과는 공간적 세포 이질성에 대한 상호 보완적인 관점을 제공하지만, 사용자가 프로토콜에 기술된 선택적 일치도 분석(concordance analysis)을 수행하지 않는 한 이를 정량적인 교차 검증으로 처리하지 않습니다. 상호작용형 관심 영역(ROI) 주석 달기를 위해 맞춤형 Python Dash 애플리케이션인 Select Spatial Spots가 통합되어 있으며, 이후의 다운스트림 분석에 사용할 수 있는 표준 좌표 기반 주석 파일을 내보냅니다.

실질적인 적용 가능성과 관련하여, 본 워크플로우는 주로 표준 어레이 기반 ST 데이터(예: 55 µm 해상도의 Visium)를 위해 설계되었으며, 파라미터 평가 후 다른 조직 유형에도 적용 가능할 수 있습니다. 분석 전 몇 가지 주요 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 참조 가이드 디컨볼루션(reference-guided deconvolution) 모듈은 고품질의 조직 일치 scRNA-seq 참조 데이터에 의존합니다. 둘째, 세포 하위 수준 또는 단일 세포에 가까운 플랫폼의 경우, 통합 전 전처리, 공간 빈 집계(spatial bin aggregation) 또는 이미지 기반 세포 분할의 수정이 필요할 수 있습니다². 대표적인 마우스 결장 데이터셋은 보편적인 플랫폼 호환성의 증거가 아니라, 본 워크플로우가 공간 도메인 및 마커 정의 조직 구조를 어떻게 평가할 수 있는지 보여주기 위한 시연 사례로 사용되었습니다.

프로토콜

본 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 데이터 세트는 공개적으로 이용 가능하며 엄격히 시연 목적으로만 사용되었습니다. 구체적인 데이터 액세션 번호와 소스 저장소는 관련 단계에 제공됩니다. 원본 데이터 세트는 각 소스 연구에 적용 가능한 기관 윤리 지침에 따라 원본 연구자에 의해 생성되었습니다. 필요한 모든 소프트웨어 및 R-패키지 버전을 확인하려면 재료 표를 참조하십시오.

하드웨어 요구 사항: 이 워크플로에 필요한 계산 메모리는 분석하는 샘플 및 스폿 수에 따라 달라집니다. 일반적인 공간 전사체 데이터셋(예: 최대 3개 샘플에 대해 샘플당 약 3,000개 스폿)의 경우, 최소 16 GB의 RAM을 갖춘 표준 워크스테이션이면 파이프라인을 실행하기에 충분합니다. 하지만 최적의 성능과 안정성을 보장하기 위해, 특히 SCTransform 정규화 및 디컨볼루션 중 행렬 분해와 같이 메모리 집약적인 계산 단계에서는 32 GB 이상의 RAM을 사용할 것을 강력히 권장합니다.

1. 데이터 획득 및 디렉토리 구조 준비

1. 공공 공간 전사체 데이터셋(예: 2021년 3월 26일 제출, 2022년 3월 6일 최종 업데이트된 GEO accession GSE169749)과 단일 세포 RNA-seq 참조 데이터(예: 2024년 4월 19일 제출, 2024년 12월 10일 최종 업데이트된 GEO accession GSE264408)를 확보한다.
2. 저장소에서 원시 데이터 아카이브(예: GSE169749_RAW.tar)를 다운로드하고 아카이브를 압축 해제한다.
   참고: 본 프로토콜에 사용된 대표 데이터셋의 경우, 압축 해제된 디렉토리에는 각 샘플에 대한 여러 파일이 포함되어 있으며, 파일 이름에는 일반적으로 GEO 샘플 accession(예: GSM5213483)이 포함되어 있다.
3. Seurat Load10X_Spatial 함수와 호환되는 표준화된 디렉토리 구조로 파일을 정리한다.
   1. 메인 데이터 디렉토리(예: ./data/)를 생성한다.
   2. 각 샘플을 위한 전용 하위 디렉토리(예: ./data/sample_A1/)를 생성한다.
   3. 각 샘플에 대한 다음의 필수 파일들을 해당 하위 디렉토리로 전송(복사 또는 이동)한다.
      1. filtered_feature_bc_matrix.h5 파일을 샘플의 메인 하위 디렉토리에 배치한다.
      2. 각 샘플 디렉토리 내에 spatial/ 하위 폴더를 생성한다.
      3. 다음 파일들을 spatial/ 하위 폴더에 배치한다: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz, 및 tissue_hires_image.png.gz.
   4. spatial/ 폴더 내의 .gz 파일들을 압축 해제한다. 원본 파일 이름이 Load10X_Spatial 함수에서 요구하는 형식(예: tissue_positions_list.csv)과 정확히 일치하는지 확인한다.
      참고: 원활한 로딩을 위한 최종 정리 구조는 샘플 A1을 예로 하여 다음과 같은 패턴을 따라야 한다:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. 소프트웨어 환경 설정

1. R (버전 4.4.3 이상)을 설치하십시오.
2. GitHub 저장소(https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, 재현성을 위해 커밋 해시 2d85e18 기준)에서 분석 스크립트(1_ReadSpatialData.R부터 8_Giotto_Communication.R까지)를 확보하십시오.
3. setup.R 스크립트를 실행하여 CRAN 및 Bioconductor에서 필요한 R 패키지를 설치하십시오.
   참고: 본 워크플로우에 사용된 특정 패키지 버전의 상세 목록은 Table of Materials에 제공되어 있으며, 관련 GitHub 저장소(https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow) 내의 session_info.txt 파일에서도 확인할 수 있습니다.
4. 공식 문서에 제공된 설치 명령어를 실행하여 Giotto Suite를 설치하십시오.
   1. 공식 설치 URL(https://giottosuite.com/articles/installation.html)로 이동하여 설정 스크립트를 가져오십시오.
   2. 단계별 안내에 따라 필요한 Python 환경 및 시스템 종속성을 초기화하십시오.
5. 시각화 향상을 위한 추가 패키지를 설치하십시오.
   1. 다음 명령어를 실행하십시오: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
6. 사용자 정의 Select Spatial Spots 도구를 설치하십시오. 운영 체제가 Windows, macOS 또는 Linux이며 Python 버전 3.8 이상이 설치되어 있는지 확인하십시오. 이 단계는 선택 사항입니다.
   1. GitHub 저장소(https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, 재현성을 위해 커밋 해시 d20946e 기준)로 이동하여 소스 코드를 다운로드하여 도구를 확보하십시오.
   2. 해당 도구의 디렉토리로 이동하여 Python 종속성을 설치하십시오: pip install -r requirements.txt
7. SCTransform 정규화 속도를 높이기 위해 BiocManager::install("glmGamPoi")를 실행하여 glmGamPoi 패키지를 설치하십시오.
   참고: 핵심 워크플로우에는 2.1~2.3 및 2.6단계에 나열된 패키지만 필요합니다. Rfast2 패키지는 Moran's I 통계량의 계산 속도를 높이는 데 사용됩니다. 2.5단계의 선택적 패키지는 Prism 스타일 테마(ggprism)를 적용한 출판용 그래프 생성 및 색맹 친화적 팔레트(colorBlindness) 사용을 위한 것입니다. 2.6단계의 도구는 대화형 스팟 선택 기능을 가능하게 합니다. sessionInfo() 명령어를 실행하고 전체 콘솔 출력을 텍스트 파일로 저장하십시오. 이는 장기적인 재현성 확보에 필수적인 정확한 소프트웨어 버전과 패키지 종속성을 기록하는 과정입니다.

3. 공간 데이터 로딩 및 품질 관리(1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. 공간 데이터를 Seurat 객체로 읽어 들입니다.
   1. 사용 Read10X_이미지 고해상도 조직 이미지를 수동으로 로드하여 다음을 지정하십시오. 이미지 디렉터리 및 이미지 이름.
   2. 사용 10X_Spatial_로드 ~와 함께 이미지 Seurat 객체를 생성하기 위해 단계 3.1.1에서 생성된 이미지 객체에 파라미터를 설정합니다.
2. 품질 관리 지표를 계산하십시오.
   1. 다음을 사용하여 미토콘드리아 리드 백분율을 계산하십시오. 백분율특징집합 패턴을 사용하여 ^mt-.
3. QC 지표를 기반으로 데이터를 시각화하고 해석하십시오.
   1. 다음의 바이올린 도표(violin plot)를 생성하십시오. 공간적_세포당_총_카운트, nFeature_Spatial, 그리고 미토콘드리아 비율 사용하여 바이올린 도표(VlnPlot).
   2. 다음을 사용하여 이러한 지표의 공간적 특성 플롯을 생성하십시오. 공간특성도(SpatialFeaturePlot) 조직 영역 외부의 스팟을 식별하기 위해.
      참고: 시각적 확인 사항: 조직 영역 외부의 스팟은 일반적으로 낮은 UMI 수치를 나타냅니다.nCount_Spatial < 500) 및 낮은 유전자 검출(nFeature_Spatial < 200)
   3. 시연을 위해, 저품질 스팟을 제거하는 필터를 적용합니다 (예: subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial) > 200 & nCount_Spatial > 500)). 이는 선택 사항입니다.
      참고: 공간 전사체학에서 품질 관리(QC)의 주된 목적은 조직 외부에 위치한 스팟과 같은 기술적 아티팩트를 식별하고 주석을 다는 것입니다. 시연용 Visium 결장 데이터의 경우, nFeature_Spatial > 200 및 nCount_Spatial > 500개의 저복잡성/배경 스팟을 제거합니다. RNA 함량이 낮거나 절편이 손상된 조직의 경우, 임계값을 높이기 전에 바이올린 플롯과 공간 특징 플롯을 확인하십시오. 밀도가 높거나 UMI 수치가 높은 조직의 경우에는 더 엄격한 임계값이 적절할 수 있습니다. 더블렛(doublets), 조직 접힘 또는 명백한 아티팩트가 보이지 않는 한 단순히 높은 발현 값만을 기준으로 필터링하는 것은 피하십시오. 필터링은 공간적 위치를 물리적으로 제거하여 이후의 공간 분석을 위한 조직 구조의 연속성을 해칠 수 있으므로 권장되지 않는 경우가 많습니다.

4. 데이터 전처리, 통합 및 클러스터링 (3_IntegrationAndClustering.R)

1. 개별 샘플을 정규화 및 전처리합니다.
   1. assay = 옵션을 사용하여 각 샘플에 대해 개별적으로 SCTransform 정규화를 적용하십시오. 공간적.
2. 여러 시료를 통합하십시오.
   1. 통합을 위해 SCT 정규화된 객체 목록을 준비합니다. 각 객체에 다음이 포함되어 있는지 확인하십시오. "RNA" 다음의 내용을 복사하여 분석(assay)하십시오. "공간적" 분석법: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["공간적"]]
      ​참고: 다음을 복사하여 "공간적" 표준 분석법으로의 전환 "RNA" assay 슬롯은 원래 단일 세포 Seurat 객체를 위해 설계된 다운스트림 통합 기능과의 호환성을 보장하기 위한 필수적인 우회 방법으로 사용됩니다.
   2. 사용 통합특징선택 및 PrepSCTIntegration 공통된 가변 특징을 식별하기 위해.
   3. 다음을 사용하여 통합 앵커(integration anchors) 찾기 FindIntegrationAnchors ~와 함께 정규화 방법 = "단일 세포 전사체 분석(SCT)".
   4. IntegrateData를 사용하여 데이터를 통합하십시오. 정규화 방법 = "단일 세포 전사체 분석(Single-Cell Transcriptomics)".
3. 통합 분석 데이터에 대해 차원 축소 및 클러스터링을 수행하십시오.
   1. 다음을 사용하여 통합된 데이터에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행하십시오. PCA 실행.
   2. 누적 설명 분산을 계산하여 후속 분석을 위한 최적의 주성분(PC) 개수를 결정하십시오. 다음의 코드를 사용하여 (예: 누적 분산이 90%를 초과하고 한계 이득이 0.1% 미만으로 떨어지는 지점과 같이) 엘보우 지점을 프로그램 방식으로 식별하십시오. 3_통합및클러스터링.R, 36-38행그 결과로 도출된 주성분(PC)의 수는 이후 다음과 같이 지칭한다. pc.use.
   3. 다음을 사용하여 RunUMAP을 실행하십시오. dims = 1:pc.use.
   4. 다음을 사용하여 세포를 클러스터링합니다. 이웃 찾기 ~와 함께 / ~를 이용하여 dims = 1:pc.use 그리고 다음을 사용하여 FindClusters를 수행합니다. 해상도 = 0.5클러스터 안정성과 마커 유전자 일관성을 확인한 후에만 해상도를 조정하십시오.
   5. 대상 그룹 간(예: "B1_결장_d14" 대비 "A1_결장_d0")를 사용하여 마커 찾기 기능
      ​참고: 시각적 확인 사항: 통합이 성공적으로 이루어지면 UMAP 플롯에서 생물학적으로 구별되는 클러스터가 유지되는 동시에 샘플들이 적절하게 혼합되어 나타납니다.
4. 공간 가변 유전자를 식별합니다.
   1. 각 원본 샘플에 대해 다음을 수행하십시오. 공간적 가변 특징 찾기(FindSpatiallyVariableFeatures) ~을 사용하여 "모란시" ~에 관한 방법 "세포 독성 검사 (SCT)" 공간 자기상관을 계산하기 위한 분석법.

5. 단일 세포 참조 데이터 전처리 (4_scDataPreProcessing.R)

1. Read10X를 사용하여 단일 세포 RNA-seq 카운트 행렬을 읽고 Seurat 객체를 생성합니다.
2. 표준 QC, 정규화 및 클러스터링을 수행합니다.
   1. 미토콘드리아 리드 비율(percent.mt)을 계산하고 세포를 필터링합니다 (예: nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. vars.to.regress = "percent.mt"로 설정하여 SCTransform으로 데이터를 정규화합니다.
   3. PCA 및 UMAP을 실행하고, 4.3.2단계에서 설명한 동적 PC 선택 방법을 사용하여 세포를 클러스터링합니다.
3. 세포 유형을 주석 처리합니다.
   1. AddModuleScore를 사용하여 전형적인 세포 유형 마커 유전자에 대한 모듈 점수를 계산합니다.
   2. 모듈 점수와 알려진 생물학적 정보를 바탕으로 클러스터를 주석 처리합니다. 또는 메타데이터에서 미리 계산된 주석을 가져옵니다.

6. SPOTlight를 이용한 참조 기반 디콘볼루션 (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. SPOTlight를 위한 데이터를 준비합니다.
   1. 주석이 달린 단일 세포 Seurat 객체와 공간 Seurat 객체를 SingleCellExperiment 객체로 변환합니다.
   2. logNormCounts를 사용하여 단일 세포 데이터를 로그 정규화(log-normalize)합니다.
2. SPOTlight 디콘볼루션을 실행합니다.
   1. modelGeneVar 및 getTopHVGs를 사용하여 단일 세포 데이터에서 고변이 유전자(HVGs)를 식별합니다.
   2. scoreMarkers를 사용하여 세포 유형 마커 유전자를 계산하고 고품질 마커(예: mean.AUC > 0.8)만 필터링합니다.
   3. 계산 시간을 단축하기 위해 각 세포 유형별 단일 세포 참조 데이터를 관리 가능한 수(예: 50개 세포)로 다운샘플링합니다.
   4. weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", gene_id = "gene" 설정을 사용하여 SPOTlight 함수로 디콘볼루션을 수행합니다.
3. 결과를 시각화하고 내보냅니다.
   1. 디콘볼루션 결과 행렬(스팟당 세포 유형 비율)을 추출합니다.
   2. plotSpatialScatterpie를 사용하여 공간 좌표상의 세포 조성을 시각화합니다.
   3. AddMetaData를 사용하여 공간 Seurat 객체의 메타데이터에 디콘볼루션 결과를 추가합니다. 예상 결과물: 각 공간 스팟에 대한 세포 유형 비율 열이 포함된 디콘볼루션 행렬, 국소 세포 조성을 보여주는 공간 scatterpie 플롯, 그리고 메타데이터로 디콘볼루션 비율을 포함하는 Seurat 객체입니다.

7. STdeconvolve를 이용한 참조-프리 디콘볼루션 (Reference-free Deconvolution)(7_STdeconvolve.R)

1. 공간 데이터를 준비하십시오.
   1. 다음과 같이 공간 Seurat 객체에서 raw count matrix를 추출하십시오. slot = 옵션을 사용한 GetAssayData "수치".
   2. 다음을 사용하여 저품질 스팟 및 유전자를 제거합니다. 정제된 카운트 STdeconvolve(예: 최소 라이브러리 크기 = 100).
2. 잠재적 세포 유형을 식별하십시오.
   1. 다음을 사용하여 최소 비율의 스폿(spot)에서 발현되는 유전자를 기준으로 코퍼스를 추가로 필터링합니다. 말뭉치 제한 (예: 상단 제거=1.0, 제거하한값 = 0.05).
   2. 다양한 잠재적 주제 수(K)(예: 등)에 걸쳐 잠재 디리클레 할당(Latent Dirichlet Allocation, LDA) 모델을 적합시키십시오. Ks = seq(2, 9, by = 1))를 사용하여 fitLDA.
   3. 다음을 사용하여 최소 퍼플렉시티(perplexity)를 기반으로 최적의 모델을 선택하십시오. opt = 로 설정된 최적 모델(optimalModel) "분".
3. 결과를 분석하고 시각화하십시오.
   1. 다음을 사용하여 최적 모델로부터 세포 유형(토픽) 비율(theta)과 유전자 프로필(beta)을 추출하십시오. betaTheta값_가져오기.
   2. 디컨볼루션된 토픽의 생물학적 해석을 돕기 위해, 다음으로 생성된 관심 영역(ROI) 주석을 가져오십시오. "공간 스팟 선택" 툴(단계 9.3.3 참조)을 사용하십시오. 이러한 주석을 groups 파라미터로 사용하십시오. 모든 주제 보기 디컨볼루션된 세포 유형 비율을 공간 좌표로 다시 투영하고 ROI(관심 영역)별로 스팟에 색상을 부여하는 함수입니다. 이는 선택 사항입니다.
      참고: STdeconvolve는 스팟당 토픽 비율을 나타내는 theta 값과 각 토픽의 유전자 프로파일을 나타내는 beta 값을 반환해야 합니다. 사용자가 비지도 학습 기반의 STdeconvolve 결과와 참조 가이드 기반의 SPOTlight 출력값(단계 6)을 정량적으로 비교하려는 경우, 두 비율 행렬(STdeconvolve의 theta 및 SPOTlight 행렬)을 모두 내보낸 후 표준 R 함수를 사용하여 스팟당 상관관계 또는 일치도 지표(예: Pearson 또는 Spearman 상관계수)를 계산할 수 있습니다. SPOTlight와 STdeconvolve 간의 정량적 비교는 선택 사항이며 핵심 워크플로우 실행에 필수적인 과정은 아니나, 이러한 분석을 수행하고자 하는 사용자는 단계 6.3.1 및 7.3.1에서 관련 출력 행렬을 확인할 수 있습니다.

8. Giotto를 이용한 공간적 세포 간 통신 분석(8_Giotto_Communication.R)

1. Seurat 객체를 Giotto 객체로 변환하십시오.
   1. 사용하십시오 createGiottoObject 함수는 raw count 행렬과 공간 좌표를 제공합니다.
2. Giotto 객체를 전처리하고 디콘볼루션(deconvolution) 결과를 추가하십시오.
   1. 다음을 사용하여 데이터를 정규화하십시오. normalizeGiotto.
   2. 다음을 사용하여 세포 메타데이터에 세포 유형 주석(예: SPOTlight 디컨볼루션을 통한 주요 세포 유형)을 추가하십시오. 셀 메타데이터 추가.
3. 공간 정보를 기반으로 한 세포 간 통신을 추론하십시오.
   1. 다음을 사용하여 공간 네트워크를 구축하십시오. 공간 네트워크 생성 (createSpatialNetwork) ~와 함께 / ~를 사용하여 방법 = "델로네" 및 이름 = "델로네 네트워크".
   2. 리간드-수용체 데이터베이스를 R 환경으로 로드하십시오. 로드된 객체는 리간드와 수용체 유전자 기호를 나타내는 두 개의 별개 열을 가진 데이터 프레임 형식이어야 합니다(예: Zenodo에서 제공하는 사전 컴파일된 마우스 네트워크: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, 2025년 4월 7일 발행 버전 v6).
   3. 실행 exprCellCellcom ~와 함께 / ~를 사용하여 클러스터_열 = "주요 세포 유형" 공간적으로 인접한 세포 유형 간의 유의미한 리간드-수용체 상호작용을 식별하기 위함입니다. 예상 결과물: 리간드-수용체 쌍, 소스 및 타겟 세포 유형 조합, log2 fold-change 값 및 보정된 P값이 포함된 결과 테이블; 유의미한 상호작용(예: p.adj) 유지 < 시각화를 위해 (0.05)를 사용한다.

9. select spatial spots를 이용한 대화형 스팟 선택 (6_SelectSpatialSpots.R)

1. 인터랙티브 도구를 위한 데이터를 준비합니다.
   1. GetTissueCoordinates를 사용하여 Seurat 객체에서 공간 좌표를 추출합니다.
2. 데이터를 포맷하고 내보냅니다.
   1. 좌표 데이터 프레임의 열 헤더가 CELL_ID, X, Y로 정확하게 지정되도록 포맷합니다.
   2. 포맷된 데이터 프레임을 CSV 파일로 내보냅니다.
3. 관심 영역(ROI) 분석을 수행합니다.
   1. 커스텀 Select Spatial Spots Dash 애플리케이션을 실행하고 CSV 파일을 로드합니다.
   2. 공간적 위치를 기반으로 스팟을 인터랙티브하게 선택합니다.
   3. 선택된 스팟 목록과 할당된 그룹/ROI 레이블을 새로운 CSV 파일로 내보냅니다. 예상 결과물: 스팟 식별자, X/Y 좌표 및 할당된 그룹/ROI 레이블이 포함된 CSV 파일이며, 이는 CELL_ID를 통해 Seurat 객체와 다시 매칭될 수 있어야 합니다.

결과

워크플로 구현 및 데이터 통합을 통해 주요 조직 특징을 설명합니다

분석 단계별 예상 결과물을 보여주기 위해 마우스 결장 공간 전사체 데이터에 계산 워크플로우를 적용하였습니다. 워크플로우 도식(그림 1)에 나타낸 바와 같이, 파이프라인은 데이터 획득 및 품질 관리부터 시작되었으며, 여기서 공간 특성 플롯을 통해 조직 경계를 획정하였습니다(그림 2A,B). 이후 해석 가능한 생물학적 변이는 유지하면서 기술적인 배치 효과를 줄이기 위해 Seurat의 앵커 기반 통합 워크플로우를 사용하였습니다. 통합 후 UMAP 시각화를 통해 샘플 정렬 및 공간 클러스터링 패턴을 확인하였습니다(그림 2C,D). 차원 축소 및 후속 클러스터링을 안내하기 위해 누적 분산을 기반으로 주성분(PCs)을 정량적이고 동적으로 선택하는 방식을 구현하였습니다(부록 그림 1 참조). 마커 유전자 히트맵 분석 결과, 공간 클러스터의 기반이 되는 뚜렷한 전사 프로파일이 나타났습니다(그림 2E).

계산 클러스터가 알려진 결장 조직학의 해부학적 구조와 일치하는지 평가하기 위해, 전형적인 층 특이적 마커 유전자의 발현 프로파일을 분석하였습니다. 점막 상피층에서는 Epcam 및 Krt8을 포함한 상피 세포 마커와 함께 술잔세포 마커인 Muc2의 발현이 나타났습니다. Col1a1 및 Vim과 같은 중간엽 및 기질 마커는 고유층과 점막하 영역을 표시하였으며, 외부의 고유근층은 Acta2 및 Tagln과 같은 평활근 구조 유전자에 의해 확인되었습니다. 이러한 계통 관련 마커들의 공간적 제한성은 통합 및 클러스터링 워크플로우가 점막에서 근층으로 이어지는 축을 따라 결장 조직의 주요 조직학적 층상 구조를 보존했다는 해석을 뒷받침합니다( Supplementary Figure 2 참조).

클러스터 검증 후, 실험 조건 간의 차별 발현 유전자(DEGs)를 식별하기 위해 하위 차별 발현 분석을 수행하였습니다(그림 2F,G). 또한, Moran's I 통계량을 사용하여 공간 가변 유전자를 식별함으로써 조직 전반에 걸쳐 유의미한 비무작위적 공간 분포를 보이는 유전자들을 강조하였습니다(그림 2H).

세포 디컨볼루션 및 공간 상호작용 네트워크를 통한 조직 미세구조 분석

단일 세포 RNA-seq 참조 데이터를 처리하여 QC 필터링(그림 3A), 비지도 클러스터링(그림 3B), 마커 유전자 검증(그림 3C), 그리고 독립적인 주석과의 일치성(그림 3D)으로 뒷받침되는 주석을 도출하였습니다. 세포 구성(그림 3E)을 통해 디컨볼루션(deconvolution)을 위한 다운샘플링 전략을 수립하였습니다. SPOTlight는 공간적 스팟 전체에 걸쳐 참조 기반의 세포 유형 비율을 추정하였으며(그림 4A,B), STdeconvolve는 공간적 세포 패턴에 대한 비지도 토픽 모델링 관점을 제공하였습니다(그림 5B). 맞춤형 Select Spatial Spots 도구는 이러한 패턴에 대한 조직학적 맥락을 제공하였습니다(그림 5A). 마지막으로, 디컨볼루션된 세포 유형 할당을 사용하여 공간 통신 분석을 수행함으로써 공간적으로 인접한 세포 유형 그룹 간의 리간드-수용체 상호작용을 식별하였습니다(그림 6A,B).

프로토콜 최적화를 통한 문제 해결 관찰 결과

프로토콜 최적화 과정에서 실질적인 체크포인트의 근거가 되는 몇 가지 문제점이 확인되었습니다. 단일 세포 참조 데이터가 조직 맥락과 제대로 일치하지 않을 때 디콘볼루션(deconvolution) 결과가 최적화되지 않았으며, 이는 가능한 경우 조직 및 종이 일치하는 scRNA-seq 데이터를 사용해야 함을 나타냅니다. 기본 파라미터를 이용한 초기 클러스터링 시도에서 예상되는 생물학적 구조가 항상 분리되는 것은 아니었습니다. PC 선택, 클러스터링 해상도 및 마커 유전자의 일관성을 검토함으로써 조직 해부학적 구조와 일치하며 공간적으로 해석 가능한 도메인을 식별하는 데 도움이 되었습니다. 이러한 관찰 결과는 사용자가 워크플로 실행 중 흔히 발생하는 분석 문제를 진단하는 방법에 대한 실질적인 사례를 제공합니다.

그림 1통합 공간 전사체 분석 워크플로. 데이터 획득 및 전처리와 고급 공간 분석에 이르는 분석 파이프라인의 도식적 표현. 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) Seurat을 이용한 데이터 로드, 품질 관리 및 다중 샘플 통합; (2) 공간 클러스터링 및 공간 가변 유전자 검출; (3) 세포 유형 디컨볼루션 ~을 통해 참조 기반(SPOTlight) 및 비지도(STdeconvolve) 방식; (4) Giotto를 이용한 공간적 세포 간 통신 분석 및 맞춤형 도구를 이용한 대화형 관심 영역 선택, 공간 스팟 선택모든 모듈의 결과가 종합되어 조직 구조와 세포 미세환경에 대한 생물학적 통찰을 도출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2데이터 통합, 클러스터링 및 차등 발현 분석. (A,B) 공간 샘플 A1 및 B1의 품질 관리 지표로, 유전자 수, UMI 수 및 미토콘드리아 유전자 백분율의 분포를 보여준다. (C) 샘플 기원(왼쪽) 및 클러스터링 정체성(오른쪽)으로 색상 구분한 통합 공간 전사체 데이터의 UMAP 시각화. (D) 조직 절편 상의 클러스터 정체성 공간 투영. (E) 각 공간 클러스터별 상위 마커 유전자의 히트맵. (F) 조건 A1_colon_d0와 B1_colon_d14 사이의 차등 발현 유전자를 나타내는 볼케이노 플롯(volcano plot). (G) 조직 절편 전반에 걸친 대표적 차등 발현 유전자의 공간적 발현 패턴. (H식별된 상위 공간 가변 유전자들의 공간적 발현 지도 ~을 통해 Moran's I 통계량으로, 왼쪽 두 패널은 샘플 A1_colon_d0의 유전자를, 오른쪽 두 패널은 샘플 B1_colon_d14의 유전자를 나타낸다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 단일 세포 참조 데이터 처리 및 주석 달기. (A) 필터링 전후 scRNA-seq 참조 데이터의 품질 관리 지표. (B) 비지도 클러스터별로 색상을 구분한 scRNA-seq 데이터의 UMAP 시각화. (C) 클러스터 전체에 걸친 표준 세포 유형 마커 유전자의 발현 점수를 나타내는 도트 플롯. (D) 주요 세포 유형이 표시된 scRNA-seq 데이터의 주석 처리된 UMAP 시각화. (E) scRNA-seq 참조 데이터셋의 세포 구성. 빨간색 점선은 계산 효율성과 세포 유형 표현의 균형을 맞추기 위해 SPOTlight 디컨볼루션 과정 중에 적용된 다운샘플링 임계값(유형당 n = 50 cells)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 세포 이질성의 공간적 디콘볼루션(deconvolution). (A,B) SPOTlight 디콘볼루션을 통해 얻은 공간적 scatterpie plot으로, 샘플 A1 (A) 및 B1 (B)의 각 스팟별 주요 세포 유형의 비율 조성을 보여준다. (C) 샘플 A1(왼쪽)과 B1(오른쪽)에서 B 세포의 대표적인 공간적 분포를 나타내며, 이는 디콘볼루션을 통해 식별된 특정 면역 세포 집단의 공간적으로 분해된 국소화 패턴을 보여준다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 5: 대화형 관심 영역 분석 및 비지도 디콘볼루션 비교. (A) 근위 결장, 원위 결장 및 기타 조직 영역에 해당하는 영역의 대화형 선택을 보여주는 맞춤형 "Select Spatial Spots" 도구의 인터페이스. (B) 샘플 A1에 대한 비지도 디콘볼루션 결과(STdeconvolve)의 공간적 스캐터파이 시각화로, (A)에서 수동으로 주석을 단 영역에 따라 스팟에 색상을 입혀 조직학 기반 주석과 계산적으로 도출된 세포 토픽 분포 사이의 일치성을 보여줌. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 공간 정보 기반의 세포 간 통신 네트워크. (A,B) 샘플 A1 (A) 및 B1 (B)에 대해 Giotto로 추론한 리간드-수용체 상호작용 네트워크. 노드는 세포 유형을 나타내고, 엣지는 유의미한 리간드-수용체 쌍(FDR < 0.05)을 나타내며, 엣지의 두께는 상호작용 강도에 대응한다. 비교 가능성과 시각적 명확성을 확보하기 위해 모든 샘플에 동일한 유의 수준 임계값(FDR < 0.05)을 적용하였으며, 각 조건별로 log2FC 순위 상위 20개 상호작용을 표시하였다. 이 네트워크는 대장 조직의 공간적 맥락 내에서 세포 유형 특이적인 통신 패턴을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 1: 차원 축소를 위한 파라미터 최적화의 정량적 평가.엘보우 플롯(elbow plot)은 주성분(PC)의 최적 개수를 동적으로 선택하는 워크플로우의 프로그램적 접근 방식을 보여줍니다. 선택 과정은 누적 표준 편차와 한계 분산 임계값(빨간색 수직선으로 표시)을 기반으로 계산되며, 이는 하위 클러스터링 단계 이전에 기술적 노이즈를 완화하면서 생물학적 분산을 포착하기 위함입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 표준 결장 층 특이적 마커를 이용한 공간 클러스터링 검증. (A) 계산 클러스터 전체에서 상피, 기질 및 평활근 마커의 농축된 발현을 보여주는 도트 플롯. (B) 대표 마커(Epcam, Col1a1, Acta2)를 조직 좌표에 다시 매핑한 공간 특징 플롯.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 프로토콜은 분석적 깊이와 실질적인 접근성 사이의 균형을 맞춘 공간 전사체 데이터 분석을 위한 종합적인 계산 워크플로우를 제공합니다. 단계별 접근 방식을 통해 초기 데이터 획득부터 고급 공간 분석에 이르는 전체 분석 파이프라인을 연구자에게 안내하며, 중요한 결정 지점과 잠재적인 오류 가능성을 강조합니다.

프로토콜의 여러 단계는 후속 결과에 미치는 영향으로 인해 특별한 주의가 필요합니다. 지나치게 엄격한 필터링은 생물학적으로 유의미한 스팟을 제거할 수 있고, 반대로 완만한 임계값은 기술적 노이즈를 유발할 수 있으므로, 품질 관리 및 필터링 임계값은 특정 조직 유형과 기술 플랫폼에 맞게 세심하게 조정해야 합니다. 정규화 방법의 선택은 후속 클러스터링 및 차등 발현 결과에 상당한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 본 파이프라인은 표준 로그 정규화 대신 SCTransform을 사용하는데, 이는 SCTransform이 단일 세포 및 공간 워크플로우에서 시퀀싱 깊이 및 기타 기술적 효과와 관련된 기술적 변동을 모델링하고 감소시키는 것으로 보고되었기 때문입니다^14,15. 통합 과정에서 통합 특성과 해상도 매개변수의 선택은 통합 강도와 생물학적 신호의 보존 사이의 균형을 맞추기 위해 신중한 고려가 필요합니다. 공간적 가변 유전자 검출의 경우, 계산 확장성과 어레이 기반 데이터의 공간적 자기상관 분석에 대한 적합성 때문에 Moran's I가 선택되었으나, 데이터셋 크기와 연구 목적에 따라 SPARK와 같은 대안적인 검출 도구를 고려할 수 있습니다¹⁶.

이 워크플로의 문제 해결 구성 요소는 한 패키지에서 다음 패키지로 출력을 전달할 때 발생하는 일반적인 상호 운용성 문제에 초점을 맞춥니다. 단일한 일반 변환 단계에 의존하는 대신, 이 워크플로는 각 소프트웨어 인터페이스에서 맞춤형 형식 변환을 사용합니다: 공간 카운트 데이터는 Seurat 통합 전에 표준 RNA assay 슬롯으로 복사됩니다. Seurat 및 단일 세포 참조 객체는 SPOTlight를 위해 SingleCellExperiment 객체로 변환됩니다. 공간 카운트 행렬은 STdeconvolve에 맞게 형식이 재구성됩니다. Seurat 유래 카운트, 좌표 및 세포 유형 메타데이터는 세포 간 통신 분석을 위해 Giotto 객체로 변환됩니다. Select Spatial Spots의 ROI 주석은 Seurat 객체로 다시 매핑할 수 있도록 CELL_ID, X/Y 좌표 및 그룹 라벨이 포함된 CSV 파일로 내보내집니다. 이러한 단계는 사용자가 호환되지 않는 assay 슬롯, 일치하지 않는 스팟 식별자, 누락된 메타데이터 열, 잘못된 좌표 형식 및 리간드-수용체 유전자 기호 불일치와 같은 일반적인 문제를 식별하고 수정하는 데 도움을 줍니다.

이 워크플로의 추가적인 특징은 단일 알고리즘에 의존하지 않고 두 가지 상호 보완적인 디콘볼루션(deconvolution) 전략을 사용한다는 점입니다. SPOTlight는 참조 기반의 세포 유형 비율 추정을 위해 기존 scRNA-seq 참조 데이터를 사용하는 반면, STdeconvolve는 참조 데이터 없이 잠재적인 전사 토픽(transcriptional topics)을 발견할 수 있게 합니다. 시연 데이터셋에서 STdeconvolve 토픽은 조직학적으로 정의된 영역과 일치하여(그림 5B), 생물학적 해석 가능성을 뒷받침했습니다. 본 프로토콜에서는 두 방법 간의 직접적인 정량적 비교를 수행하지 않았으며, 자신의 데이터로 이를 벤치마킹하고자 하는 사용자는 프로토콜 단계 7.3.2에서 제공하는 프레임워크를 따르면 됩니다. 또한, 본 프로토콜은 핵심 기능에는 스크립트를 사용하고 직관적인 ROI 분리를 위해 그래픽 인터페이스(Select Spatial Spots)를 제공함으로써 사용 편의성과 추적 가능성을 지원합니다.

Seurat과 Giotto를 연동하면 Seurat 기반의 전처리 및 통합과 Giotto 기반의 공간 통계 및 네트워크 분석을 결합한 워크플로우를 구축할 수 있습니다. Seurat은 scRNA-seq 경험이 있는 연구자들에게 익숙한 환경을 제공하며 다중 샘플 통합을 지원하는 반면, 조화된 데이터를 Giotto로 전송하면 공간 네트워크 구축과 리간드-수용체 분석이 가능해집니다. 이러한 설계는 사용자가 두 플랫폼의 입증된 강점을 모두 활용할 수 있도록 하며, 이것이 Squidpy나 다른 프레임워크와 비교하여 벤치마킹되었음을 의미하는 것은 아닙니다. 세포 간 통신 분석의 경우, 동일한 분석 환경 내에서 공간적 인접성을 통합하는 Giotto의 Delaunay 네트워크 기반 리간드-수용체 추론 방법을 사용하였습니다. CellChat과 같은 프레임워크는 광범위한 신호 전달 데이터베이스를 제공하지만, 본 프로토콜에서는 평가하지 않았습니다¹⁷.

몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 참조 기반 디콘볼루션(deconvolution) 방식은 고품질의 일치하는 단일 세포 참조 데이터의 가용성에 결정적으로 의존합니다. 또한, 세포 간 통신 분석의 기본 가정은 전사체 공동 발현을 물리적 단백질 상호작용의 대리 지표로 사용하는 것이므로, 이후의 실험적 검증이 필요합니다. 마지막으로, 본 워크플로우는 주로 표준 Visium 데이터셋을 중심으로 개발되었습니다. Visium HD와 같은 단일 세포에 가까운 해상도 기술로 분야가 발전함에 따라 분석적 고려 사항이 변경될 것입니다. 더 높은 해상도의 데이터는 서로 다른 전처리 파라미터를 필요로 할 수 있으며, 스팟 디콘볼루션의 절대적인 필요성을 줄일 수 있습니다. 이 워크플로우를 Visium HD 데이터셋에 적용하려면, 고해상도 빈(bin)을 컴퓨터 연산을 통해 더 큰 공간 빈으로 집계하거나, 스팟 디콘볼루션 모듈을 생략하고 이미지 기반 세포 분할(cell segmentation) 방식을 사용할 수 있습니다¹⁸.

이러한 특징들은 발생 생물학, 신경 과학, 암 연구 및 면역학을 포함한 다양한 생물학적 분야로의 잠재적 적용 가능성을 시사합니다^19,20,21,22. 모듈식 설계를 통해 연구자는 공간적 도메인 식별, 세포 간 통신 또는 지역적 특성화 중 연구 목적에 따라 특정 구성 요소를 맞춤형으로 조정하여 사용할 수 있습니다. 공간 기술이 지속적으로 발전하고 데이터 세트가 확장됨에 따라, 본 프로토콜은 새로운 분석 방법을 통합하고 새롭게 제기되는 생물학적 질문을 해결하기 위해 확장 가능한 기반을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	고급 데이터 시각화
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	공간 네트워크 및 세포-세포 간 통신 분석
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	플롯 구성 및 배치
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	핵심 실행 환경 (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	단일 세포 품질 관리 및 시각화
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	단일 세포 분산 모델링 및 마커 검출
Select Spatial Spots (사용자 정의 Python 도구)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	대화형 공간 관심 영역(ROI) 선택 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	공간 데이터 전처리, 통합 및 클러스터링
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	단일 세포 및 공간 데이터를 위한 데이터 구조
SingleCellExperiment	Bioconductor Core Team	v1.28.1 (Bioconductor)	scRNA-seq를 위한 표준화된 데이터 컨테이너
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	참조 가이드 기반 공간 디컨볼루션
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	비지도 잠재 토픽 모델링
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	핵심 데이터 조작 및 포맷팅 스위트