현탁 T 세포 및 3D 세포 모델에서 저입력 CRISPR 유전체 편집 및 mRNA 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

요약

이 프로토콜은 디지털 마이크로유체 전공 플랫폼인 'DMF-ection'을 사용하여 원차 인간 T 세포에서 TCRα/β 수용체의 소형화된 CRISPR–Cas9 유전체 편집을 설명합니다. 이 방법은 병렬, 저입력 유전자 편집을 높은 생존율로 가능하게 하며, 다세포 3D 구형체에 mRNA 전달에도 추가적으로 적응할 수 있습니다.

초록

디지털 마이크로플루이딕(DMF) 전기천공은 포유류 세포의 정밀하고 저용량 유전적 조작을 가능하게 하며, 세포 입력을 최대 100배까지 최소화하고 생존 가능성을 유지합니다. 본 연구는 1차 인간 현탁 T 세포에서 TRAC 유전자의 CRISPR 매개 녹아웃과 3차원 HEK293T 구체의 mRNA 형질전환을 위한 고처리량 DMF 기반 트랜스펙션 워크플로우를 제시합니다. 공간적으로 침착된 CRISPR 가이드 RNA와 카트리지 내 리보핵단백질(RNP) 조립을 사용하여, CD4⁺ 및 CD8⁺ T세포 집단에서 조건당 10,000개의 세포만으로 효율적인 TRAC 유좌 파괴가 달성되었으며, 후편집 생존율은 85%를 초과하였습니다. 유동 유도 및 테일러 분산 분석을 이용한 생물물리학적 특성 분석 결과, 고분자 첨가제가 전기천공 완충 조건에서 Cas9–sgRNA 복합체를 안정화하여 서브 마이크로리터 부피에서의 재현 가능한 편집을 지원한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 워크플로우는 3D 응용에 맞게 EGFP mRNA를 온전한 HEK293T 구상체에 전달하여 구형 성장이나 형태를 저해하지 않으면서도 견고하고 공간적으로 균일한 형광을 구현했습니다. 이 결과들은 DMF 전기천공이 현탁 면역세포와 다세포 구체 모두에서 효율적인 게놈 편집과 mRNA 전달을 가능하게 함을 보여줍니다. 이 플랫폼은 CAR-T 세포 치료, 기능적 유전체학, 고급 3D 세포 모델 응용을 위한 확장 가능하고 저입력 솔루션을 제공합니다.

서론

1차 인간 세포에서의 유전자 편집은 면역공학, 희귀질환 모델링, 기능 유^{전체학 등} 치료 개발과 기초 연구 모두에서 점점 중심적인 역할을 하고 있습니다. 전기천공은 매우 효율적인 게놈 편집을 가능하게 하지만, 기존의 쿠벳 기반 시스템은 일반적으로 한 질환당 수백만 개의 세포를 필요로 하여 환자 유래 샘플과 희귀 면역 집단에 대한 사용이 제한됩니다². 또한, 처리량, 자동화, 시^{약 소비의} 한계로 인해 대규모 스크리닝에는 적합하지 않습니다.

마이크로유체 전기포공은 저입력 유^{전체 편집에} 유망한 접근법으로 부상했습니다. 그러나 대부분의 기존 플랫폼은 복잡한 유체 처리, 제한된 시약 혼합 유연성, 그리고 상대적으로 높은 조건별 셀 요구사항을 포함하는 연속 흐름 구조에 의존하고 있습니다. 반면, 디지털 마이크로플루이딕스(DMF)는 평면 전극 배열 위 내 이산 나노리터 규모의 물방울을 능동적으로 조작할 수 있게 하여 반응 조성, 타이밍, 공간 위치 지정을 정밀하게 제어할 수 있게 합니다. 이 플러그 앤 플레이 드롭렛 기반 형식은 1차 세포와 시약의 보존^{이 필수적인} 저부피, 고처리량 워크플로우에 매우 적합합니다.

최근 연구는 삼중 방울 전기천공 구조를 이용한 DMF 기반 세포내 전달의 실현 가능성을 입증했으며, 이는 국소적이고 저전류의 전기장을 생성하여 효율적인 RNP와 mRNA 전달을 가능하게 하면서 열 및 전기화학적 스트레스를 최소화하는 방식입니다. ^6,7,8. 이 기반 위에 48개의 독립적으로 주소 지정 가능한 반응 부위, 완전 자동화 호환성, 확장 가능한 카트리지^{제조 9}(그림 1)을 갖춘 차세대 DMF 전기천공 플랫폼인 'DMF-ection'이 개발되었습니다. DMF 카트리지는 하단 PCB 플레이트와 플라스틱 상단 플레이트로 구성되며, 가스켓으로 분리되어 있으며, 정렬 스냅으로 단일 올바른 방향으로 조립됩니다(그림 1A). 48-plex 레이아웃은 8개의 동일한 계열(그림 1A–H)으로 구성되며, 각 계열은 6개의 독립적으로 주소 지정 가능한 전기천공 부위를 포함하고 있으며, 카트리지당 최대 48개의 병렬 편집 조건을 지원합니다(그림 1B). 가이드 RNA 라이브러리는 카트리지 조립 전에 음향 디스펜서를 사용해 기판 표면에 증착됩니다. 48개 부위 모두에서 위치 정확도가 확인되었으며, 드롭 위치는 전극 중간점에서 서브밀리미터 편차(그림 1C) 내에 모여 신뢰성 있는 카트리지 내 RNP 조립을 지원하였습니다. 장전 후 셀과 액체 전극 방울이 카트리지에 작동하여 삼액 전기공 기하학을 형성합니다(그림 1D). 전기천공 후 세포는 배양 플레이트로 분리되어 회수 및 후속 분석(플로우 사이토메트리, 시퀀싱, 현미경 등)을 포함합니다(그림 1E). 이 시스템은 표준 큐벳 기반 방법에 비해 최대 100배 적은 세포로 고효율 게놈 편집을 가능하게 하여, 저입력 및 고처리량 응용 분야에서 게놈 공학의 접근성을 크게 확장합니다.

이 연구는 mRNA와 CRISPR–Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체를 포함한 여러 생체분자 화물을 전달하여 플랫폼의 성능을 평가하여 효율적인 형질전환과 유전자 교란을 달성합니다. 1차 T 세포 외에도, DMF-ection은 핵산을 복잡한 다세포 구조에 전달하는 일반화 가능한 틀을 제공합니다. 3차원(3D) 구형체와 오르가노이드 모델은 구조와 취약성 때문에 시약 침투에 상당한 장벽을 두며, 기존의 전기천공 방식은 형태학을 방해하거나 이질적인 전달을 유발하는 경우가 많습니다. T세포 편집에 사용되는 동일한 소형 전기천공 원리가 구조화된 조직에도 적용되는지 평가하기 위해, DMF 워크플로우를 3D HEK293T 구상체에 적용하였습니다. 이 실험들은 DMF 기반 전기습윤이 삼액 형상 내에서 온전한 구체를 부드럽게 위치시키고, 구조와 성장을 보존하면서 균일한 mRNA 전달을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 결과들은 여기서 설명한 주요 T-세포 프로토콜 밖에 있지만, 신약 발견 및 질병 모델링과 관련된 신흥 3D 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 DMF 전기천공이 더 널리 적용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 1차 인간 T 세포는 상업 공급자로부터 사전 동의 하에 제공되었으며, 관련 기관, 윤리, 규제 지침을 준수하였습니다. 인간 유래 생물학적 물질의 모든 취급은 기관 생물안전 프로토콜에 따라 이루어졌습니다. 이 프로토콜을 시행하는 연구자는 1차 인간 세포 사용이 지역 기관 심사 위원회(IRB) 또는 윤리 위원회 요건, 적용 생물안전 규정, 그리고 인간 생물학적 물질 사용을 규율하는 관련 국가 또는 지역 법률을 준수하는지 책임이 있습니다. 이 연구에 사용된 세포 물질에는 환자 식별 가능한 정보가 없었습니다.

1. 1차 인간 T 세포의 준비 및 활성화

1. 37 °C 수욕에서 1차 인간 CD3⁺ T 세포를 빠르게 냉동 보존합니다. 세포를 예열된 기저 T세포 배지로 옮기고 180 × g 에서 10분간 원심분리합니다. 상원액을 버리고 펠릿을 새 배지에 다시 부탁하세요.
2. 자동 세포 계수기를 사용해 세포 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
3. 1×¹⁰ 6 세포/mL 용량의 T세포 배양 배양지에 재현탁하며, 공급업체 지침에 따라 용해성 사양체 항체 CD3/CD28 T세포 활성화 자극제와 200 IU/mL IL-2를 보조합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 72시간 배양합니다.
   참고: 활성화 시 세포 밀도를 0.5–2 × 10⁶ cells/mL 사이로 유지하세요. U-bottom 96-웰 플레이트에서 활성화를 수행하여 세포와 활성화자 간 접촉 및 활성화 효율을 최적화합니다.

2. DMF 기판 내 가이드 RNA 스팟 준비(음향 디스펜서 스포팅)

1. 핵효소가 없는 물에서 100 μM의 재고 농도로 동화된 sgRNA를 재구성합니다. 별도의 튜브에서 100 mg/mL의 폴리-L-글루탐산 재고(PGA, 나트륨염, MW 15,000–50,000 Da)를 뉴클레아제 무첨가물에 준비합니다. sgRNA와 PGA 재고를 5:4 부피비(sgRNA: PGA)로 결합하면 최종 sgRNA 농도는 55.6 pmol/μL, 최종 PGA 농도는 44.4 mg/mL로 나옵니다. 1,000 g 에서 잠시 원심분리× 30초간 소용돌이로 하며, 일회용 부피로 나누어 사용하지 않은 분량은 −80°C에서 최대 6개월간 보관합니다.
   참고: 반복되는 동결-해동 사이클은 피하세요.
2. 가이드-PGA 혼합물을 원하는 반응 부위 배치에 대응하는 웰의 저죽음 음향 소스 플레이트에 추가합니다.
3. 보정된 음향 디스펜서를 사용하여 가이드-PGA 혼합물의 40 nL(2.2 pmol sgRNA에 해당)을 DMF 기판의 각 표적 스포팅 영역에 전달합니다.
   참고: 55.6 pmol/μL에서 40 nL은 부위당 2.2 pmol sgRNA를 제공합니다(55.6 × 0.040 = 2.22 pmol). 건조된 가이드는 액적 합류 시 카트리지에서 재구성됩니다; 완전한 재정지는 사이트 간 일관된 편집 효율성으로 확인됩니다.
4. 생물학적 안전 캐비닛에서 점액이 있는 방울을 상온에서 완전히 자연 건조하여 보이는 액체가 사라질 때까지 약 5분간 기다립니다.
   참고: 강제 공기 흐름이나 열은 가이드 RNA를 떨어뜨리거나 분해할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
5. DMF 카트리지를 조립하세요.
   1. 생물학적 안전 캐비닛에서는 상단 플레이트를 반점 기판 위에 정렬시키고, 상단 플레이트의 비대칭 플라스틱 스냅 기능과 하단 플레이트의 홈을 맞추도록 합니다. 짧은 가장자리에 고르고 동시 압력을 가해 뚜렷한 기계적 스냅 소리가 느껴지면 잠금 기능이 완전히 맞물리는 것을 확인합니다.
      참고: 탄환은 단일 올바른 방향으로 설계되었으며; 잘못된 조립은 스냅 소리를 내지 않습니다. 기질을 항상 가장자리로 잡아 오염이나 손상을 방지하고, 기질이 서로 미끄러지면 표면 코팅이 긁힐 수 있습니다.
   2. 체크포인트: 기계식 스냅으로 올바른 조립을 확인하세요.
      참고: 코팅 무결성을 미리 측정하는 전기적 표시기가 없습니다; 부적절한 조립으로 인한 기능 실패는 자동으로 감지되어 실행 후 품질 관리 보고서에 보고됩니다.
      일시정지: 사용하지 않은 조립된 카트리지를 밀봉된 포장에 흡습제(실리카 젤 봉지)와 함께 실온에서 최대 48시간 보관하세요.

3. 세포 준비

1. 각 사용 전에 DMF 호환 전기천공 버퍼와 제공된 생체 적합성 비이온 계면활성제를 20:1(v/v) 비율로 결합하여 1mL의 완전 transfection 버퍼를 새로 준비하여 최종 계면활성 농도는 0.05%(v/v)를 만듭니다. 부드럽게 섞고 얼음 위에 보관하세요.
   참고: 여기서 사용된 DMF 호환 트랜스펙션 버퍼는 저전도도, 등장성 완충제(전도도: 3.5 mS/cm, 삼투압: 305 mOsm/L)입니다. 대체 버퍼를 사용하는 연구자는 DMF 작동과 세포 생존 가능성과의 적합성을 검증해야 합니다. 생체적합성 비이온 계면활성제는 방울 핀을 줄이는 역할을 합니다; 제공된 계면활성제가 사용되지 않는다면, 적절한 대체물로 사용한다.
2. 활성화된 T 세포를 변속 버퍼(계면활성제 없음)로 한 번 세척합니다. 180 × g 에서 5분간 원심분리하고, 상원액을 흡인한 후 세포 펠릿을 계면활성제 함유 1.0 × 10^{7 셀/} mL로 카트리지당 100 μL 용량으로 재현탁합니다. 얼음 보관하세요.
3. 카트리지에 장전하기 직전에 Cas9 뉴클레아제를 100 μL T-셀 현탁액에 직접 첨가하고 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다; 얼음 보관하세요.
   참고: 1차 T 세포의 경우 Cas9는 100 μL 카트리지 부피당 42 pmol(0.42 pmol/μL)으로 적재됩니다. 각 전기천공 부위는 약 1 μL의 세포 현탁물을 처리하며, 편집당 0.42 pmol Cas9를 전달합니다. 다른 면역 세포 유형에 적응할 때는 이 용량을 최적화하세요( 표 1 참조).

구성 요소	편집 각 최종 농도
Cas9	0.42 pmol ⁉ μL 방울
sgRNA	2.1 pmol (40 nL 스팟에서)
PGA	스포팅 믹스에 44.4 mg/mL 스톡
계면활성제	0.05% (v/v)
셀 입력	~10,000 셀

표 1: 각 트랜스펙션 드롭의 최종 농도 요약표.

4. DMF 생성 플랫폼에서의 트랜스펙션

1. 멀티채널 피펫을 사용해 8개의 셀 로딩 포트 각각에 10 μL의 T-셀/Cas9 혼합물을 투여하고, 16개의 액체 전극 로딩 포트에 10 μL의 완전한 트랜스펙션 버퍼를 분사합니다( 그림 1 참조).
2. 전압을 500V, 펄스 시간을 3ms, 펄스 수를 2로 설정하세요. 플랫폼 지침에 따라 전기천공 시퀀스를 시작하세요.
   1. 체크포인트: 달리기 직후 QC 보고서를 검토하세요. 산발적인 실패(<10%)는 개입이 필요하지 않습니다. 고장이 체계적으로 발생하면 카트리지를 제공된 QC 보드로 교체하고, 시스템 건강 점검(~2분)을 실행한 후 문제가 계속되면 기술 지원에 연락하세요.

5. 편집된 T 세포의 오프로드 및 회복

1. 액체 핸들러를 사용해 각 반응 부위에서 전기천공된 세포를 96웰 U-바닥판으로 옮기며, 이 배지에는 150 μL의 예열된 기저 T-세포 배양지와 200 IU/mL IL-2가 보충됩니다.
2. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 72시간 동안 배양하여 단백질 교체와 표면 수용체 발현 변화를 허용합니다.

6. TRAC 녹아웃의 유세포검사 분석

1. 세척 사이의 세포 손실을 줄이기 위해 멸균된 96웰 원뿔형 바닥판으로 세포를 옮깁니다. 400 × g 에서 원심분리하여 5분간 원심분리하고 원뿔형 바닥판을 부드럽게 뒤집어 상원액을 제거하여 플로우 사이토메트리 버퍼(1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA)로 세포를 두 번 세척합니다. 세포는 플레이트 내에 남아있습니다.
2. 제조사 권장 농도로 유동 세포 차단기 버퍼에서 항-CD4, 항-CD8, 항-TCRα/β 항체를 포함한 표면 염색 마스터 믹스를 준비합니다. 우물당 마스터 믹스 25 μL을 추가하고 4 °C에서 빛을 차단한 상태로 20분간 배양합니다. 1× PBS(FBS 제외)로 400 × g 에서 원심분리기로 5분간 두 번 세척하세요. 생존 염료가 포함된 1× PBS 100 μL에 세포를 재현탁하고, 빛으로부터 보호된 상온에서 10분간 배양합니다.
   참고: 원뿔형 바닥판은 세포 펠릿에 효과적입니다; 모든 단계에서 세포가 잘 재현탁되어 있는지 점검하세요.
3. 유동 세포분석 버퍼로 세포를 두 번 세척한 후 샘플당 150–200 μL에 재현탁하여 채취합니다.
4. 세포계는 사용되는 형광색소에 맞는 적절한 레이저 라인과 필터 세트로 구성하세요(예: 생존성 염료는 488nm 여기, 표면 마커는 405nm 또는 488nm). 단일 염색 보상 조절과 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전압을 설정합니다. 샘플당 최소 5,000건의 라이브 싱글렛 이벤트를 수집하세요. 순차적으로 게이트: 살아있는 세포→ 산란 단일 입자(생존 염료 음성) → → TCRα/β 발현을 .
   참고: 표준 조건에서는 세포가 증식한 시간이 있었기 때문에 세척과 염색 과정에서 손실된 후 샘플당 5,000에서 10,000 이상의 생체 반응이 발생할 수 있습니다.
5. CD4⁺ 및 CD8⁺ 집단 내에서 TCRα/β음성 세포의 빈도를 측정하여 TRAC 유전자 교란을 규명합니다. 각 하위 집합에 대해 살아있는 싱글렛 게이트에 비해 TCRα/β 음성 세포의 비율로 녹아웃 효율을 보고합니다.

결과

예상 결과
10,000개의 활성화된 T 세포를 전기천공하면 일반적으로 형질인화 후 72시간 후 >85%의 TRAC 녹아웃 효율과 >95%의 생존율을 보입니다. 유세포 검사 결과, TRAC 표적 조건에서 비표적 sgRNA 대조군(NTC)과 전기장에 노출되지 않은 대조군에 비해 TCRα/β 염색이 명확히 소실되어 있음을 확인할 수 있습니다. 별도 명시가 없는 한, n은 별도의 날에 수행되는 독립적인 DMF 실험 실행을 나타냅니다. 동일한 카트리지 연속에서의 기술적 복제는 통계 분석 전에 평균을 내어 n에 독립적으로 기여하지 않습니다. 여기서 보고된 모든 T 세포 실험은 단일 건강한 기증자로부터 얻은 냉동 보존 세포를 사용하여 수행되었습니다. 같은 플랫폼을 사용한 기증자 간 변동성은 추가로⁹.

음이온 고분자 첨가제로 ...

토론

이 프로토콜은 나노리터 규모의 방울을 이용해 1차 인간 T 세포에 효율적인 세포 내 전달을 가능하게 하는 소형 디지털 마이크로유체 전기천공 워크플로우를 설명합니다. 이 방법의 핵심 장점은 반응당 10,000개의 세포만으로 CRISPR–Cas9 게놈 편집을 수행할 수 있어 기존 전기천공에 비해 재료 요구량을 크게 줄인다는 점입니다. 드롭렛 기반 아키텍처는 자동화를 지원하여 여러 병렬 사이트에서 시약 처리 및 반응 조립이 재현 가능하도록 보장합니다.

이전 연구들에서 DMF-ection 플랫폼을 널리 사용되는 시스템과 직접 벤치마킹한 결과, 기존 뉴클레오펙션은 1회 편집당 10,000 세포에서 2% 미만의 GFP 양성 T 세포를 생성하는 반면, DMF-ection 플랫폼은 동일한 저입력 조건에서 >90%의 형질전환 효율을 달성했습니다. 192가지 조건으로 배열된 스크린에 대해 DMF 플랫폼은 기존 방법

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	기기
1x PBS	Gibco		유동 버퍼
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	구형 세포 프로토콜
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	구형 세포 프로토콜
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		기기
DMEM Media	Gibco	10564011	Spheroid culture용 미디어 보충제
DMF compatible buffer	DropGenie		세포 형질전환
DropGenie Transfection System	DropGenie		기기
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		유동 버퍼
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		기기
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Spheroid culture용 미디어 보충제
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		기기
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		구형 세포 프로토콜
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		냉동보존된 말초 혈액, 부정적 선택된 pan CD3+ 보조 T 세포
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T 세포 활성화 미디어
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T 세포 활성화 미디어
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		기기
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	기기
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3’
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Spheroid culture용 미디어 보충제
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/ml의 농도로 사용
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		소프트웨어
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	구형 세포 프로토콜
Surfactant F	DropGenie		세포 형질전환 - DMF 호환 버퍼에 1:20으로 사용하여 완전한 형질전환 버퍼를 만듭니다
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3’
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	구형 세포 프로토콜