인터루킨-10 녹아웃 마우스에서 염증으로 인한 대사 변화 연구를 위한 피록시캄 가속 장염 모델

요약

이 프로토콜은 인터루킨(IL-10) 녹아웃 마우스 모델에서 피록시캄을 사용하여 대장염 발달을 가속화합니다. 프로토콜은 대장염의 동기화를 보장하여 성별, 배경 변종, 비바리움 상태와 무관하게 엄격하고 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이는 장 염증 중 대사 변화를 연구하는 데 유용한 모델로 작용합니다.

초록

염증성 장 질환(IBD)은 전 세계적으로 1,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 소화관의 만성 염증성 질환입니다. IBD의 면역학적 기전과 결과에 대한 상당한 연구가 집중되어 있지만, 점막 염증이 체중 감소와 식욕 감소 등 대사 조절 장애에 어떻게 기여하는지에 대해서는 아직 덜 알려져 있습니다. 여기서 저자들은 인터루킨-10-녹아웃(IL-10-KO) 마우스에서 피록시캄 가속 장염의 마우스 모델을 설명하여 염증에 의한 대사 조절 이상을 연구합니다. IL-10-KO 마우스는 자발성 장염을 앓는 것으로 알려져 있으며, 감염이나 약물에 의해 유발되는 장염에 더 취약합니다. 그러나 이 모델에서 비바리움 환경과 긴장 배경이 대장염 발병의 교란 요인으로 보고된 바 있습니다. 비스테로이드성 소염제(NSAID)인 피록시캄은 동물 모델에서 점막에 하강균 노출을 증가시켜 장염을 유발하거나 가속화하는 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜에서는 수컷과 암컷 IL-10-KO 쥐에게 일반 차우 식이 대신 피록시캄 강화 식이를 제공했습니다. 음식 섭취량과 체중은 전신의 대사 변화와 설사, 직장 출혈 같은 장대장염의 임상 증상을 반영하기 위해 매일 측정되었습니다. 이 프로토콜은 효율적이고 재현성이 뛰어나며, 여러 마우스에서 동시에 장염을 유도하고, 염증성 장질환 모델에서 대사 조절 이상을 평가할 수 있게 합니다. 이 프로토콜을 사용한 추가 연구는 장대장염이 에너지 소비와 체성분 등 대사 조절의 다른 요소에 미치는 영향을 조사하여 염증성 장 질환과 숙주 대사 간의 더 넓은 연관성을 밝힐 수 있습니다.

서론

크론병과 궤양성 대장염은 통칭하여 염증성 장질환(IBD)으로, 점막 염증을 특징으로 하며, 복통, 체중 감소, 혈체화, 설사 등의 임상 증상을 동반하는 만성 자가면역 질환입니다. IBD는 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치며, 서구화된 사회에서 가장 높은 유병률을 기록하고 있습니다¹. 미국에서는 300만 명 이상^{이 영향을 받는} 것으로 추정^{되며, 특히} 어린이와^{청소년에서} 발생률과 유병률이 증가하고 ^{있습니다.}

IBD 발병의 정확한 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 이 질병은 유전적으로 감수성이 있는 개인에서 장내 미생물군에 대한 과도한 면역 반응에서 비롯된 것으로 널리 알려져 있습니다. 염증 반응을 조절하는 사이토카인은 장내 항상성 유지와 IBD 발생에 중요한 역할을 합니다. 이 중 인터루킨-10(IL-10)은 선천적 및 적응적 면역 반응 팔을 조절하여 인간의 면역학적 항상성을 유지하는 데 도움을 주는 잘 연구된 항염증 사이토카인입니다 ^6,7. 특히, IL-10과 그 수용체(IL-10RA/B)에서 다형성이 매우 조기 발병된 IBD(VEO-IBD)에서 확인되었으며, 고전적으로^{생후 몇} 달 이내에 항문주질환을 발병하는 8. 이 연관성은 크론병 성인 환자의 대규모 엑솜 시퀀싱으로도 뒷받침되는데, IL-10RA가 비단일유성 IBD⁹에서 질병 감수성 유전자임을 확인했습니다. 더욱이, VEO-IBD 환자에서 IL-10 중화 항체를 포함하는 비유전적 경로가 보고되어 점막 면역 항상성 유지에 이 경로가 중요함을 더욱 강조합니다^.

IL-10이 IBD에 연관이 있음을 밝힌 인간 연구를 바탕으로, 인터루킨-10-녹아웃(IL-10-KO) 마우스를 IL-10이 IBD에서 어떤 역할을 하는지 연구하는 모델로 개발되었습니다. IL-10-KO 마우스는 보통¹¹세 8주에서 12주경에 자극에 과장된 CD4+ Th1 반응을 보이는 자발성 장염을 발병하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 IL-10-KO 마우스에서 가속 요인이 없을 때 자연성 장염의 발병은 유전적 균주, 미생물 구성, 서식 조건에 따라 예측할 수 없을 수 ^{있습니다. 12,13,14}. 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용하여 대장염을 유도하는 것은 IL-10-KO 모델이 실용적으로 활용되기 위해 매우 중요합니다. 이전 연구들은 피록시캄과 같은 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)를 사용하여 IL-10-KO 마우스에서 장염을 유도한 바 있습니다^17,18. 그러나 이 연구들은 주로 면역학적 변화에 초점을 맞추고 있으며, 장대사에 미치는 영향이나 성별이 대장염 중^증도에 미치는 역할에 대해서는 상대적으로 덜 강조하고 있습니다. 저자들은 IL-10-KO 마우스에서 장염을 유도하기 위해 피록시캄 강화 식이를 사용하고, 수컷과 암컷 마우스를 모두 이용한 모델에서 대사 조절 이상과 점막 염증 반응을 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전신의 대사 변화뿐만 아니라 대장염의 임상 증상과 점막 염증을 반영하는 조직학적 및 전사체 변화를 반영하기 위해 체중과 음식 섭취를 측정합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 모델은 IBD와 숙주 대사 간의 연관성을 조사하는 데 귀중한 도구를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며, "실험동물 관리 및 사용 가이드"[승인 번호: 2017-102011]에 따라 진행되었습니다. 안락사는 기관 지침에 따라 이루어졌습니다. 시술에 마취는 필요하지 않았습니다. 재료에 대한 구체적인 세부 사항은 재료표에 설명되어 있습니다.

1. IL-10-KO 마우스에서 피록시캄 가속 장염 모델 확립

1. IL-10-KO 쥐는 특정 병원체가 없는 시설에서 12시간 광 주기로 유지하며, 자유 롭게 식사와 물을 섭취할 수 있도록 합니다.
2. 7주에서 8주 된 생후 나이와 성별이 일치하는 쥐들을 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용합니다. 실험 시작 최소 일주일 전까지 쥐들이 단일 사육과 매일 만지는 환경에 적응할 시간을 두세요.
   참고: 수컷은 체중이 >20g, 암컷은 >17g이어야 하며, 쥐는 싸움 상처가 없어야 합니다.
3. 쥐를 실험군과 대조군에 배정하세요. 실험 그룹의 경우, 표준 주먹 대신 피록시캄 강화 식사를 하세요. 대조군에게는 신선한 표준 음식을 제공하세요. 각 케이지 호퍼에 50g 차우를 넣으세요.
   참고: 각 그룹마다 성별당 최소 다섯 마리의 쥐를 할당하세요. 피록시캄 강화 음식(200 ppm)은 테클라드가 연구진이 제공한 피록시캄을 이용해 맞춤형 실험동물 사료를 제작하기 위해 준비한 것입니다. 배치별 변동성을 최소화하기 위해, 실험 내 모든 동물이 동일한 생산 배치에서 먹이를 받는 것이 권장됩니다. 가능하다면 동일한 배치를 실험 간에 사용해 재현성을 높여야 합니다.

2. 체중 및 섭식 행동 모니터링

1. 분석 저울을 사용해 각 쥐의 체중을 기록하세요. 매일 같은 시간에 쥐 한 마리씩 개별적으로 체중을 재세요, 7일 연속으로 매일 측정하세요. 0일차에 기준 체중의 백분율로 일일 체중을 보고하세요(100%로 설정).
   참고: 체중이 20% 이상 감소하면 과도한 스트레스와 임박한 사망 위험을 나타냅니다. 이 임계값에 도달하면 쥐는 안락사해야 합니다.
2. 분석 저울을 사용해 각 우리에서 피록시캄 강화 주우와 표준 주우의 초기 무게를 기록하세요.
3. 그 후 매일 같은 시간에 각 케이지 호퍼에 남은 고기를 측정하며, 7일 연속으로 매일 측정합니다.
4. 하루 차우 섭취량을 전날 남은 차우에서 빼서 계산합니다.
   참고: 식사량을 정기적으로 확인하고 10g 미만이면 리필하세요. 피록시캄 차우의 맛은 섭취에 영향을 주지 않으며 일반 식료와 매우 유사해야 합니다.

3. 질병 활동 모니터링

1. 0일차와 7일째에는 개별 쥐의 배설 펠릿을 육안으로 확인하여 대변에 혈액이 있는지 확인하세요.
2. 혈액이 보이지 않으면 검사 카드에 펠릿을 바르고 제공된 현상액을 첨가하여 대변 잠혈 검사를 수행하세요. 점수 결과는 표 1에 따른 것입니다.
3. 0일차와 7일째에는 새로 배출된 대변 펠릿을 눈으로 확인하여 대변 상태를 확인하세요. 평평한 겸자를 사용해 일관성을 판단하는 데 도움을 주세요. 점수 결과는 표 1에 따른 것입니다.
4. 0일차와 7일차에는 항문 주위 부위를 검사하여 직장 탈출의 정도를 확인합니다. 점수 결과는 표 1에 따른 것입니다.
5. 위에서 설명한 대로 체중을 측정하세요. 점수 결과는 표 1에 따른 것입니다.
   참고: 질병 활동 지수(DAI) 점수 산정은 일관성을 보장하고 관찰자 편향을 최소화하며 평가의 신뢰성을 높이기 위해 실험 내내 동일한 연구자가 맹목적으로 수행해야 합니다.

4. 대장 조직 채취

1. 다른^곳에서 보고된 대로_CO2 질식사 및 경추 탈구로 쥐를 안락사시키세요.
2. 쥐를 등을 대고 눕히고 복부 복부에 70% 에탄올을 뿌리세요.
3. 겸자로 피부를 들어 올리고 수술용 가위로 중앙선을 따라 절단하세요. 복막 강을 노출하고 결장을 찾아보세요.
4. 둔기 해리로 대장과 맹장을 노출하세요. 맹장과 항문 커프를 포함한 대장을 한 덩 어리 제거하세요.
5. 대장을 평평한 표면에 놓고 결합 조직을 제거하세요.
6. 대장 길이를 측정하고 기록하세요.
7. 대장 길이를 측정한 후, 맹장-대장 접합부를 절단하여 맹장을 제거합니다.
8. 10mL 주사기와 인산 완충 생리식염수(PBS)를 준비하고, 22게이지 볼 팁 재사용 강철 가베지 바늘을 부착합니다. 바늘을 대장에 꿰어 장 내용물을 씻어내세요.
9. 플러닝된 대장을 PBS가 포함된 페트리 접시에 넣고 잔여 내용물을 제거하기 위해 세척하세요. 허가가 나면 하류 분석에 사용하세요.

5. 조직학 분석

1. 대장을 유리 슬라이드 위에 평평하게 눕히세요. 겸자를 사용해 조직을 말단 끝에서 시작해 스위스 롤(Swiss roll)을 만들어 스스로 감아주세요. 이렇게 말위/항문 끝은 내측 롤에 머무르고, 더 근접한 부위는 바깥 롤까지 확장됩니다.
2. 27게이지 바늘을 사용해 말린 대장을 고정해 필름을 고정한 후 삽입 조직 카세트에 넣으세요.
3. 조직을 고정하기 위해 조직 카세트를 10% 완충된 포르말린 용액에 4 °C에서 16시간 동안 담근다.
   주의: 10% 포르말린은 피부에 닿으면 해롭고 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 보호용 장갑과 과학용 고글을 착용하여 조심하세요. 잔류 포르말린은 기관 지침에 따라 적절히 처리되어야 합니다.
4. 포르말린 고정 후에는 파라핀 임베딩을 위한 조직을 처리하여 유리 슬라이드에 부착하기 위해 절단합니다.
   참고: 샘플은 조직 카세트를 파라핀 처리, 스크롤 절단, 슬라이드 마운팅, 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위한 필요한 장비를 갖춘 조직학 실험실에 제출해야 합니다.
5. 헤마톡실린과 에오신(HE)으로 염색 조직을 슬라이드하며, 정립된 프로토콜에 따라²¹.
6. 표 2에 설명된 조직학적 점수 시스템을 사용하여 각 절의 조직학적 특징을 평가합니다: 장염으로 인한 조직 손상, 고유층 염증 세포 침윤, 그리고 관여 면적 비율. 각 섹션의 점수를 합산하여 총 점수를 산출합니다(표 2).
   총점 = 특징 × 침범(조직 손상) + 특징 × 침범 특징 (Lamina propria 염증 세포 여과) (1)
7. 조직 손상과 세포 침윤의 대표적인 조직병리학적 이미지는 Erben 등(²²)의 논문에서 확인할 수 있습니다.
   참고: 조직학적 점수 매기는 평가의 일관성과 신뢰성을 보장하기 위해 가능하게, 가능하면 훈련된 병리학자가 수행해야 합니다.

6. 포르말린 고정 파라핀 조직의 면역형광 염색

1. 휴지 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 55°C 슬라이드 건조기에 1시간 동안 넣어 파라핀을 녹입니다.
2. 슬라이드를 염색 선반에 놓고, 선반을 3분간 염색 병에 자일렌을 담가둡니다. 이 과정을 세 번 반복하세요.
3. 스테인링 선반을 100% 에탄올이 담긴 스테인링 병에 3분간 담가세요. 이 과정을 세 번 반복하세요.
4. 염색 선반을 염색 병에 95% 에탄올과 함께 3분간 담가세요.
5. 염색 선반을 80% 에탄올이 섞인 염색 병에 3분간 담가세요.
6. 염색 선반을 염색 병에 5분간 담가두고, 탈이온수(DI)를 담가세요.
   참고: 자일렌 연기 때문에 이전 모든 단계는 환기 후드에서 수행해야 합니다. 보호용 장갑과 과학용 고글을 착용하여 조심하세요. 잔류 자일렌은 기관 지침에 따라 적절히 처리되어야 합니다.
7. 슬라이드를 슬라이드 랙에 옮기고 1× 시트레이트 추출액이 담긴 염색 병에 담가둡니다.
8. 스테인링 병을 스테인링 접시 지지대에 넣으세요.
9. 염색 접시 지지대를 압력솥에 넣으세요.
10. 압력솥에 15분간 조리하세요.
11. 압력솥에서 슬라이드를 회수해 실온까지 식히세요.
12. 300 μL 차단 버퍼(3.5% 염소 혈청을 PBS에 희석한 것)를 사용해 가습 챔버에서 1시간 동안 인큐베이팅합니다. 조직이 차단 완충제로 완전히 덮여 있는지 확인하세요.
13. 300 μL 1차 항체를 블로킹 버퍼에 희석한 상태에서 4 °C에서 16시간 동안 가습 챔버 안에서 노출시킵니다. 조직이 1차 항체로 완전히 덮여 있는지 확인하세요. 다음 1차 항체가 사용되었습니다: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    참고: 항체 희석은 시약별로 적용되며 공급자의 권고를 따라야 합니다.
14. 린스 슬라이드를 PBS에 3번에 걸쳐 5분간 연속적으로 담가서 스테인링 병에 넣습니다.
15. 슬라이드를 300 μL 희석된 형광 2차 항체를 차단 버퍼 안에서 1시간 동안 실온에서 가습 챔버에서 노출시킵니다. 조직이 2차 항체로 완전히 덮여 있는지 확인하세요. 다음 형광 2차 항체가 사용되었습니다: 염소 항-토끼 알렉사 플루어 555(1:150 희석).
    참고: 이 시점부터는 형광체의 광표백을 방지하기 위해 슬라이드를 빛으로부터 보호해야 합니다. 2차 항체 희석은 시약별 특이적이며, 공급업체의 권고를 따라야 합니다.
16. 린스 슬라이드를 PBS에 3번에 걸쳐 5분간 연속적으로 담가서 스테인링 병에 넣습니다.
17. 슬라이드를 핵 염색에 노출시키기 위해 1:5000 PBS에 희석된 호에스트 용액에 20분간 담그고 염색 병에 담가세요.
18. 린스 슬라이드를 PBS에 3번에 걸쳐 5분간 연속적으로 담가서 스테인링 병에 넣습니다.
19. 비연마성 조직으로 슬라이드에 묻은 PBS를 조심스럽게 닦아내세요. 50 μL 안티페이드 마운팅 매체와 커버슬립을 추가하세요.

7. RNA 추출

1. 대장 전체나 조각을 액체 질소에 급동한 후 -80 °C에서 보관하세요. 또는 1.5mL RNALater 보존액에 담근 후 제조사의 지침에 따라 보관하세요.
2. 미리 냉동된 대장을 녹여서 평평한 표면에 올려놓으세요. 휴대용 호모지나이저로 조직을 파괴하고 균질화하세요.
3. 제조사의 지침에 따라 키트를 사용해 RNA를 분리하세요.
4. 분광광도계를 사용해 RNA 농도를 측정하세요. ₂₆₀/A₂₈₀ 비율 > 1.8, A의₂₆₀/A₂₃₀ 비율이 2.0–2.2는 허용 가능한 RNA 순도를 나타냅니다.
5. 역전사를 진행한 후 SYBR 그린 삽입 염료를 사용한 qPCR을 시행합니다.
6. 정량화 플랫폼이나 유사한 도구를 사용해 결과를 분석하세요.

결과

수컷과 암컷 IL-10-KO 마우스는 피록시캄 강화 식이에 짧은 노출 후 장대장염이 발생한다(그림 1A–E). 2일째 되자, 피록시캄 노출 쥐는 동성 일반 급여 대조군보다 통계적으로 유의하게 더 큰 체중 감소를 보였으며, 성별에 따라 유사한 체중 감소가 관찰되었습니다(그림 1B). 피록시캄 노출과 장대장염 발병 기간 동안 겉보기 일일 음식 섭취량은 변하지 않았으며, 표준 음식 섭취와 유사하여, 이 모델에서 체중 감소가 주로 섭취 감소에 의해 촉진되는 것이 아니라 대사 소비를 촉진하는 다른 요인에 의해 촉진됨을 시사한다(그림 1C).

장 염증의 진행 과정을 추가로 조사하기 위해, 질병 활동성은 체중 감소, 대변 혈혈, 대변 농도, 직장 탈출 정도의 종합 점수로 평가하였다. 수정 질병 활동 지수(DAI)는 기저선과 7일차에 평가되었으며; 7일차 점수는 그림 1D에 표시되어 있습니다. 또한, 피록시캄 노출 마우스에서 관찰된 장염 발병은 사망률 증가 경향과 강한 관련이 있었으나, 이 차이는 통계적으로 유의미하지는 않았습니다(p = 0.12; 그림 1E). 이 모델에서 조기 사망은 쥐가 인도적 종점(체중 감소> 20%)에 도달한 것에 의해 발생하며, 수컷에게 우선적으로 영향을 미칩니다(그림 1E). 사망률이 실험적 최종 지표로 고려된다면, 여기서 사용한 것보다 더 많은 실험 동물을 고려할 수 있습니다. 본 연구에서 저자들은 예상 사망률을 고려하여 연구 완료를 통해 통계적 검정력을 달성하는 데 필요한 최소 동물 수를 사용했습니다.

대장이 짧아지는 마우스 모델에서 대장염의 심각도와 관련된 특징입니다. 수확 시, 피록시캄 사료를 먹인 수컷과 암컷 IL-10-KO 쥐 모두 일반 사료를 먹인 쥐보다 대장이 짧았습니다(그림 2A–B). 조직학적 평가 결과, 피록시캄 투여군의 대장은 상피 손상과 면역 세포 침윤 증가, 대장염과 관련된 변화를 보였다(그림 2C). 이러한 발견은 더 높은 조직학적 점수로 이어졌습니다(그림 2D). 또한, 인간 IBD와 대장염 마우스 모델에 관여하는 염증성 사이토카인의 전사 수준도 평가^{되었습니다.} 이전 보고서와 일치하여, 피록시캄 사료 IL-10-KO 마우스의 대장은 전사체 수준에서 염증성 사이토카인의 유의미한 상향 조절을 보였습니다(그림 3A–D). 주목할 점은, 이 전사 변화는 일반 초우 또는 WT 생쥐에서 피록시캄 강화 식단을 섭취한 경우에는 관찰되지 않았으며, 이는 전사 서명이 IL-10 결핍과 피록시캄의 결합에 의해 유발되었음을 시사한다. 마지막으로, 저자들은 피록시캄 처리 생쥐에서 관찰된 전사 서명이 대장 점막에서 칼프로텍틴 염색 증가와 연관되어 있음을 확인했습니다(그림 3E)^24,25.

그림 1: IL-10-KO 마우스에서 피록시캄 가속 장염 . (A) 실험 프로토콜의 개략적 개요. (B) 체중, (C) 음식 섭취, (D) 7일차 질병 활동 지수(DAI), (E) 피록시캄 강화 식이 또는 일반 식단을 받는 8주 된 수컷과 8주 된 암컷 IL-10-KO 마우스의 생존 곡선. 남성 대조군: n = 5, 남성 피록시캄: n = 5, 여성 대조군: n = 6, 여성 피록시캄: n = 6 in (B), (C), (D). 남성 대조군: n = 6, 남성 피록시캄: n = 10, 여성 대조군: n = 6, 여성 피록시캄: n = 7 in (E). * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, 수컷(상단 별표)과 암컷(하단 별표) 마우스를 쌍별로 비교하여 (B) 지역에서 얻었습니다. 통계 분석은 (B), (C), (D)에서 양측 무쌍 t-검정을, (E)에서 로그 랭크 검정을 사용하여 수행하였습니다. 평균값과 평균의 표준오차(SEM)를 나타내는 오차 막대가 표시됩니다. 막대 차트에서는 개별 측정값이 지터 플롯으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 대장경 단축 및 조직학적 평가. (A) 8주 된 수컷 및 암컷 생쥐의 대표 대장 표본으로, 피록시캄 식단(위) 또는 일반 식단(아래)을 7일간 투여받은 경우. 7일차 대장장 길이 기준 체중계 기준 기준 체중계 기준 = 1 cm. (B) 대장(남성 대조군: n = 5, 남성 피록시캄: n = 5, 여성 대조군: n = 6, 여성 피록시캄: n = 6). (C) HE 염색된 대장의 대표 이미지. 스케일드 바 = 100 μm. (D) 7일차 조직학 점수. (B)와 (D)에서의 양측 무쌍 t-검정. SEM을 나타내는 평균값과 오차 바가 표시되어 있습니다. 막대 차트에서는 개별 측정값이 지터 플롯으로 표시됩니다. 유의성 없음(NS), * p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001 쌍별 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 피록시캄 가속 장염에서의 염증 변화. 수확 시점에 8주 된 야생형(WT) 및 인터루킨-10-KO(IL-10-KO) 수컷 마우스의 대장 조직에서 (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b , (D) Ifng 의 정량적 RT-PCR 결과. 패널 A–D의 경우, WT 피록시캄 n = 7, KO 피록시캄 n = 6, KO 대조 n = 3. (E) 8주 된 IL-10-KO 마우스의 대장 조직에 대한 대표적인 칼프로텍틴 면역형광 염색 검사. 통계 분석은 양측 무쌍 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 평균값과 평균의 표준오차(SEM)를 나타내는 오차 막대가 표시됩니다. 막대 차트에서는 개별 측정값이 지터 플롯으로 표시됩니다. 스케일 바 (E) = 200 μm. 유의성 없음(NS), * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 쌍별 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

도메인	음악
무게	0 – 변경 없음
	1 – 1–5% 손실
	2 – 6–10% 하락
	3 – 11–20% 하락
	4 – ; 20% 이상의 손실
변 질도	0 – 보통;
	1 - 부드럽지만 형성된 형태
	2 – 묽은 변 (묽지 않음)
	4 – 설사(묽은 변)
출혈	0 – 없음
	2 – 혈구성 변 양성
	3 – 대변에 피가 눈에 띈 것
	4 – 직장당 대출혈
직장 탈출증	0 – 결석
	1 – 현재
총 점수	총점: 각 도메인별 (도메인 점수)의 합계

표 1: 질병 활동 점수(DAI). 체중 감소, 변 농도, 대변 혈혈, 직장 탈출증을 기준으로 질병 활동을 평가하는 점수 체계. Sifuentes-Dominguez 외²⁶쪽에서 각색함.

조직 손상					Lamina propria 염증성 세포 침윤
특징		참여			특징		참여
0	전혀 없습니다	1	면적의 1–25%		0	드문	1	면적의 1–25%
1	드물게 발생;	2	표면의 26–50%		1	호중구 수치가 증가했다	2	표면의 26–50%
2	점막 침식과 궤양	3	표면의 51–75%		2	염증성 세포 군집의 점막하 존재	3	표면의 51–75%
3	장벽 깊숙한 곳에 광범위한 손상	4	표면의 76–100%		3	벽을 이루는 세포 침투	4	표면의 76–100%

표 2: 조직학적 점수 체계. 조직학적 변화와 손상을 판단하는 점수 체계. Sifuentes-Dominguez 외²⁶쪽에서 각색함.

토론

염증성 장 질환은 복잡한 다유전자 질환으로, 전임상 모델이 IBD 발병 기전을 해부하고 새로운 진단 및 치료 전략을 개발하는 데 귀중한 도구가 됩니다. 현재 많은 IBD 전임상 모델은 덱스트란 황산염나트륨(DSS), 옥사졸론, 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)과 같은 화학물질 노출에 의존하고 있습니다. 자발성 대장염을 발병시키는 유전적 모델도 존재합니다. 이 중 IL-10-KO 모델은 특히 가치가 있는데, IL-10 경로의 유전적 변이가 인간에서 장 염증을 유발하는 것으로 알려져 있으며, IL-10-KO 마우스는 인간 질환과 유사한 자발성 만성 장염을 발병하기 때문입니다. 하지만 이 모델의 주요 한계는 표현형 변이를 설명하지 못한다는 점입니다. 장대장염은 자연적으로 발생하지만, 발병 배경과 비바리^{움 환경에 따라} 다양할 수 있습니다.

화학 노출과 유전적 모델을 결합함으로써, 여기서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험적 대장염 마우스 모델을 제공합니다. IL-10-KO 마우스에서는 피록시캄에 의해 장대장염이 가속화되며, 피록시캄 강화 식이 노출 후 7일 이내에 질병이 발병합니다. 이 프로토콜은 대장염 발병 동기화를 가능하게 합니다. 이 모델은 체중 감소, 대변 혈액, 설사, 결장 단축, 조직학적 손상, 전사 변화 등 다른 일반적으로 사용되는 대장염 모델에서 관찰된 특징들을 재현합니다. 더불어, 이 모델은 널리 사용되는 C57Bl/6J 균주에서 재현 가능하며, 이는 IBD와 관련된 추가 유전자 결함을 조사할 수 있도록 하여 이 균주에서 추가 돌연변이를 가진 쥐를 비교적 쉽게 생성할 수 있게 합니다.

여기서 설명한 모델은 장 염증 중 대사 변화를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 이 모델에서는 피록시캄에 노출된 가속된 장염이 발생한 쥐들은 일일 섭취량이 크게 줄어들지 않고 정상적으로 계속 먹는다. 이는 이 모델에서 체중 감소가 섭식 장애 때문이 아니라 추가적인 요인 때문임을 시사합니다. 이러한 결과가 염증으로 인한 칼로리 소비 증가, 설사를 통한 과도한 칼로리 손실, 또는 열생성 기능 저하 때문인지 여부를 규명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 더불어, 수컷과 암컷 마우스는 질병 중증도에서 유사한 양상을 보이며, 이는 IL-10-KO와 DSS 모델에서의 이전 관찰과 대조되는^{28, 29, 30}.

이 모델의 재현성을 보장하기 위한 여러 중요한 문제 해결 단계가 있습니다. 첫째, 쥐는 피록시캄 노출 전 일주일간 매일 다루고 관찰하는 데 적응해야 합니다. 이로 인해 스트레스로 인한 체중 감량이 방지됩니다. 둘째, 우리에는 쥐를 세 마리를 넘지 않아야 하며, 실험에는 조화롭게 사육된 쥐만 포함되어야 합니다. 싸움 행동이나 싸움 상처를 보이는 쥐는 대장염 발병에 더 취약하며 수확 전에 사망할 수 있습니다^31,32. 셋째, 실험 내내 음식 섭취를 모니터링하려면 쥐를 개별적으로 보관하여 정확한 주먹 섭취량을 측정할 수 있어야 합니다. 또한, 먹이 호퍼에는 크고 온전한 사료 펠릿만 넣어야 하며, 이는 값에 영향을 줄 수 있는 깔개 속으로 부서지는 것을 방지해야 합니다. 여기서 설명한 음식 섭취량을 정량화하는 방법은 공개된 설치류 식품 섭취 지침³³에 부합합니다. 마지막으로, 실험 중에는 케이지 교체를 피해야 하며, 특히 어린 쥐에서 갑작스러운 환경 변화로 인해 1–2일간 먹이 섭취가 줄어들 수 있습니다.

이 프로토콜에는 여러 제한이 있습니다. 첫째, 대사 변화 평가는 체중과 음식 섭취량에 한정되며, 호흡 교환율(RER), 에너지 소비, 신체 활동과 같은 전신 대사 지표는 평가되지 않았습니다. 또한, 체중 감량의 기전은 조사되지 않았으며; 따라서 음식 섭취 감소, 에너지 소비 변화, 흡수 장애 및 기타 장내 염증과 관련된 요인들의 상대적 기여도는 명확하지 않습니다. 둘째, 대장 조직만 수집 및 분석되었으며, 지방 조직, 간, 골격근 등 대사 조절에 관여하는 다른 기관들은 검사하지 않았습니다. 셋째, 이 프로토콜은 C57BL/6 IL-10-KO 마우스를 사용하여 개발되었으며, 이 마우스는 다른 유전적 배경과 비교해 대장염에 대한 감수성이 다를 수 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 프로토콜은 추가 대사 표현형 분석과 장 외 조직 분석을 쉽게 통합할 수 있어, 체중 감량의 기전과 장 염증과 전신 대사 변화 간의 관계 조사를 가능하게 합니다³⁴ 또는 새로운 항염증 나노물질 평가³⁵. 더 나아가, 이 접근법은 다른 IL-10-KO 마우스 품종에도 적용 가능해야 하지만, 추가적인 검증 연구가 필요합니다.

요약하자면, 저자들은 여러 IL-10-KO 마우스에서 동시에 장염을 유도하고 섭식 행동을 평가할 수 있는 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 보고합니다. 이 모델에서 장대장염이 에너지 소비와 체성분에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 추가 연구가 필요하며, 이를 통해 IBD와 숙주 대사 간의 더 넓은 연관성을 밝혀냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon