멘델 무작위화, 공동위치 분석, 요약 데이터 기반 멘델 무작위화, 약물 예측을 이용한 심부전 표적 탐색

요약

이 연구는 유전적 분석을 통해 심부전의 잠재적 약물 표적을 8가지, 그리고 이들과 관련된 후보 치료제를 탐구하였습니다.

초록

심부전(HF)은 진행된 단계에서 삶의 질을 크게 저하시키는 흔한 심혈관 질환입니다. 다양한 치료 전략에도 불구하고, HF의 질병 부담은 여전히 상당합니다. 따라서 새로운 치료 표적을 탐구하는 것이 시급히 필요합니다. 본 연구는 멘델 무작위화(MR)를 활용해 약물 투여 가능한 유전자와 HF 간의 인과관계를 평가하였으며, 공동위치 분석과 요약 데이터 기반 멘델 무작위화(SMR)를 통해 이들 간의 관계를 더욱 검증하였다. 마지막으로, HF의 잠재적 치료 표적은 8가지가 확인되었으며, 여기에는 4개의 위험인자(CYP11A1, GALT, KCNH2, METRN)와 4개의 보호 인자(APOM, CHD4, IL11RA, LPAR5)가 포함되었습니다. GO 농축, KEGG 농축, 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석은 이 유전자들이 주로 대사 조절과 심장 전기생리학적 과정에 관여함을 보여주었습니다. 더불어, 약물 예측과 분자 결합을 통해 미토탄, 아델, 벤조푸란, 1,3-디오-톨릴구아니딘, 96-69-5, 브로모에놀 락톤 등 이 표적을 표적으로 하는 잠재적 약물들이 확인되었습니다. 더 나아가 PCR 결과는 미토탄이 CYP11A1 및 KCNH2와 연관될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 잠재적 치료 표적을 기반으로 설계된 약물은 더 높은 성공률을 제공하고 임상 결과를 개선할 수 있습니다.

서론

심부전(HF)은 심실 충전력 또는 심근 수축력 저하로 정의되는 흔한 심혈관 증후군으로, 대사 요구를 충족시키기 위해 심박출량이 부족해지는 것으로 정의됩니다 ^1,2,3. 임상적으로 HF는 폐 및 전신 울혈, 조직 저관류, 호흡곤란, 피로, 말초 부종과 같은 증상으로 특징지어집니다 ^1,4,5. 치료법의 발전에도 불구하고, HF는 전 세계적으로 이환율과 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 글로벌 질병 부담(GBD) 연구 ^6,7,8에 따르면 6,400만 명 이상이 영향을 받고 있습니다. 막대한 질병 부담은 새로운 치료 전략의 긴급한 필요성을 강조합니다.

현재 HF에 대한 약물학적 및 기기 기반 중재는 최적 효능 부족과 부작용으로 제한되어 지속적으로 높은 재입원률과 삶의 질 저하에 기여하고 있습니다 9,10,11,12. 따라서 HF 발병과 인과관계를 가진 새로운 분자 표적을 규명하는 것은 임상 결과 개선에 매우 중요합니다. 유전체학을 신약 개발에 통합하는 것은 효율성을 높이는 매우 효과적인 전략으로, 유전적으로 검증된 치료법이 임상시험에서 유의미하게 높은 성공률을 보여준다^{13, 14, 15}. 더불어, 이러한 실행 가능한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 소분자와 단클론 항체 모두에 대한 주요 치료 표적으로 작용한다^16,17.

인간 유전학의 최근 발전은 유전체 전체 연관 연구(GWAS)와 발현 정량적 형질 유전자좌(eQTL) 데이터의 통합 분석을 통해 약물 표적 우선순위 지정을 용이하게 했습니다. 멘델 무작위화(MR)는 유전 변이를 도구적 변수로 활용하여 인과 효과를 추정하며, 관찰 연구에서 내재된 교란과 역인과관계를 최소화합니다^13,14. 공존 위치 및 요약 기반 MR(SMR)과 결합하면, 이 접근법은 질병 위험에 영향을 미칠 수 있는 조절 유전자의 강력한 우선순위 지정을 가능하게 하여, 표적 발견을 위한 유전적 고정 전략을 제공합니다 18,19,20. 기존의 연관성 연구와 비교할 때, MR, SMR, 공위치화를 통합하면 교란과 역인과관계를 극복하여 견고한 인과적 추론을 도출합니다. 더 나아가, 이 프레임워크는 유전자 발현과 심부전 위험이 동일한 근본적 인과 변이를 공유하도록 하여 연관 불균형에서 발생하는 거짓 양성 신호를 걸러내어 표적 우선순위를 최적화합니다. 심혈관 조직은 높은 특이성을 보이지만, 본 연구는 통계적 검정력을 극대화하기 위해 주로 대규모 혈액 cis-eQTL 데이터를 활용한다는 점이 주목할 만합니다. 이 접근법이 HF에 내재된 조직 특이적 기전을 완전히 포착하지는 못할 수 있지만, 혈액 유래 변이는 접근 가능한 바이오마커로서 질병의 전신 유전적 요인에 대한 강력한 통찰을 제공합니다.

본 연구에서는 대규모 GWAS 및 eQTL 데이터셋을 사용하여 약물 투여 유전자가 HF 위험에 미치는 인과관계를 평가하였습니다. 유의미한 연관성은 공존 위치 측정과 SMR 분석을 통해 추가로 검증되었습니다. 우선순위가 정해진 표적의 생물학적 기능을 밝히기 위해, 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 풍부화 분석, 그리고 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석이 수행되었습니다. 치료 잠재력은 이후 약물 예측과 분자 결합을 통해 평가되었습니다. 마지막으로, 선택된 약물 투여 가능 유전자와 후보 약물 간의 연관성을 시험 관 내 실험을 통해 검증되었습니다.

결론적으로, 본 연구는 HF의 새로운 치료 표적 발견에 중요한 통찰을 제공합니다. MR, SMR, 공동위치 분석, 유전자 풍부 분석, PPI 네트워크 구축, 약물 예측, 분자 도킹, 시험관 내 실험 등을 활용하여 이러한 발견은 HF에 대한 보다 효과적인 치료 전략 개발에 기여할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구에 사용된 모든 데이터셋은 이전에 윤리적 승인을 받은 연구에서 수집되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 연구 설계

이 연구의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 첫째, 약물 투여 유전자의 시스-eQTLs에서 노출 데이터를 얻었습니다. 둘째, 약물 유전자와 HF 간의 인과관계를 조사하기 위해 MR 분석을 수행하였고, 이후 공동定位 및 SMR 분석을 통해 HF의 후보 치료 표적을 확인하였다. 이후 유전자 풍부 분석과 PPI 네트워크 구축이 수행되었습니다. 마지막으로, 약물 예측과 분자 결합을 통해 약물의 유전자 친화도를 탐구하였습니다.

2. 데이터 출처

총 6,888개의 약물 투여 유전자가 두 곳에서 확인되었습니다. 한 데이터셋에는^{여러 데이터 소스}를 통합한 이전 연구에서 나온 4,463개의 유전자가 포함되어 있었습니다. 다른 데이터셋에는 약물-유전자 상호작용 데이터베이스(DGIdb)에서 5,012개의 유전자가 포함되어 있었습니다²¹. 자세한 정보는 웹사이트(https://www.dgidb.org/)에 실려 있습니다. 중복 유전자를 합치고 제거한 후, 6,888개의 고유 약물 투여 유전자가 분석을 위해 보존되었습니다.

Cis-eQTL 데이터는 eQTLGen 컨소시엄(https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html)에서 수집되었으며, 31,684개의 혈액 샘플에서 발현 프로필을 포함하고 16,987개의 유전자를 포함합니다²².

HF 요약 통계는 FinnGen^{데이터베이스 23}의 R12 릴리스에서 얻었으며, 여기에는 37,653건의 사례와 462,695건의 대조군이 포함되었습니다. HF 진단은 국제질병분류(ICD)에 기반했으며, ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428, ICD-8—42700|42710|428|7824를 포함하였다. 모든 참가자는 유럽계 혈통이었습니다. 자세한 정보는 FinnGen 웹사이트와 원문 기사(https://www.finngen.fi/en/access_results)에서 확인할 수 있습니다.

3. 멘델 무작위화 분석

기구 변수(IV)는 세 가지 핵심 MR 가정을 바탕으로 선택되었습니다²⁴. 첫째, IV는 노출 요인과 직접적으로 연관되어 있습니다. 둘째, IV는 교란 요인과 관련이 없습니다. 마지막으로, IV는 노출만을 통해서만 결과에 영향을 미칩니다. 근위 eQTL이 표적 유전자에 대해 더 즉각적이고 강력한 조절을 수행함에 따라, MR은 생물학적 근접성을 극대화하기 위해 유전자의 100 kb 영역 내에 위치한 SNP만을 독점적으로 활용했습니다. SNP 선출에는 엄격한 기준이 적용되었다. 선택된 모든 SNP는 각 약물 유전자의 전사 시작 부위 상류 100 kb 이내, 전사 종료 부위 100 kb 이하에 위치했습니다. 유전체 전반에 유의성을 가진 SNP(p < 5×^10-8)만²⁵명을 포함하였다. 연관 불균형(LD)을 최소화하기 위해 LD 클러닝은 r² 임계값 0.001과 클러클링 거리 10,000 kb²⁶을 사용하여 수행되었습니다. F-통계량>10을 가진 SNP는 다음과 같은 공식으로 계산되어 유지되었습니다: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]²⁷. SNP 정보는 보충표 1에 제공되어 있습니다.

주요 분석 방법은 역분산 가중치(IVW)와 Wald 비율이었습니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다^28,29. 거짓 발견률(FDR)을 적용하여 p-값을 조정하여 위양성 결과를 최소화하였습니다³⁰. 하나의 SNP만 있을 때는 Wald 비율 방법이 사용되었으며; 그 외에는 IVW가 적용되었습니다. 분석에는 MR-Egger, 가중 중앙값, 가중 모드, 그리고 충분한 SNP가 존재할 때 단순 모드가 포함되었습니다.

코크란 Q 검정과 MR-에거 인터셉트 분석을 사용하여 이질성과 다면성(pleiotropy)을 검증하였다. Q-p-값이 0.05를 초과하면 이질성이 없음을 나타냈다³¹. MR-Egger 절벽의 p-값이 0.05 미만이면 방향성 다면형성¹⁸의 존재를 나타냈다. 마지막으로, 단일 SNP에 의해 결과가 영향을 받을 수 있는지 확인하기 위해 '제외-1-아웃' 테스트가 수행되었습니다. MR 분석은 R(버전 4.4.2)의 TwoSampleMR 패키지(버전 0.6.11)를 사용하여 수행되었습니다.

4. 공지역화 분석

coloc R 패키지(버전 6.0.1)를 사용하여 공유 유전 변이가 유전자 발현과 HF 위험에 영향을 미치는지 확인하기 위해 공동 위치 분석을 수행했습니다^. SNP가 두 형질과 연관될 확률은 각각 1 × ^10-4 , 1 × ^10-5로 설정되었습니다. 다섯 가지 가설의 사후 확률은 다음과 같이 계산할 수 있습니다: (1) PPH0: SNP는 두 형질과 연관되어 있지 않습니다. (2) PPH1/PPH2: SNP는 유전자 발현 또는 HF와 관련이 있습니다. (3) PPH3: SNP는 HF 및 유전자 발현과 연관되어 있지만, 서로 다른 SNP에 의해 구동됩니다. (4) PPH4: SNP는 HF 및 유전자 발현과 연관되어 있으며, 일반적인 SNP에 의해 유도됩니다. PPH4 > 0.8은 공동 위치의 증거로 간주되었습니다.

5. SMR 분석

SMR 분석은 SMR 소프트웨어(버전 1.3.1^)를 사용하여 유전자와 HF 간의 관계를 탐구하기 위해 수행되었습니다. 의존 기기의 이질성(HEIDI) 검사는 관찰된 연관성이 연관성 때문인지 여부를 판단하기 위해 수행되었습니다. 유의미한 SMR p값(< 0.05)과 HEIDI p값 0.05> 결합된 것은 연관 시나리오에 의한 연관성보다는 진정한 인과관계를 뒷받침하는 증거로 해석되었습니다. 상세한 운영 프로토콜과 계산 설정은 공식 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.

6. 농축 분석

GO 및 KEGG 농축 분석을 통해 선별된 잠재적 치료 표적 유전자의 생물학적 기능과 경로를 특성화하였다³⁴. GO 농축에는 생물학적 과정(BP), 분자 기능(MF), 세포 구성 요소(CC)가 포함되었습니다. R 패키지 clusterProfiler(버전 4.14.6)와 Pathview(버전 1.46.0)가^35,36 번의 농도 분석을 수행하기 위해 사용되었습니다.

7. 후보 약물 예측

잠재적 치료용 화합물을 식별하기 위해 약물 시그니처 데이터베이스(DSigDB)(http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷를 사용하여 약물 예측 분석이 수행되었습니다. DSigDB에는 22,527개의 유전자 세트가 포함되어 있으며, 이 중 17,389개의 고유 화합물이 19,531개의 유전자를 포함합니다. 후보 유전자와 화합물 간의 연관성을 분석한 후, HF 관련 유전자를 표적으로 하는 잠재적 관련 약물을 규명하기 위해 농축 분석을 수행하였습니다.

8. 단백질 상호작용 네트워크 구축

단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸을 사용하여 구축되었습니다. GeneMANIA는 유전자 기능 가설 생성, 유전자 목록 분석, 기능 검사 우선순위 지정 등에 도움을 줄 수 있습니다.

9. 분자 도킹

분자 도킹은 유전자의 약물 적합성과 약물 후보와의 관계를 검증하기 위해 수행되었습니다. 도킹 시뮬레이션은 화합물과 표적 단백질 간의 결합 친화도와 상호작용 패턴을 평가하여 후보 우선순위 지정과 최적화에 도움을 줍니다. 단백질 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)(http://www.rcsb.org/)에서 추출되었고, 화합물 구조는 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹에서 얻었습니다. 도킹은 공동체 감지를 이용해 블라인드 도킹^40,41을 유도하는 CB-Dock2(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php)를 사용해 수행되었습니다. 상세한 운영 절차와 계산 설정 정보는 공식 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.

10. 세포 배양

인간 불멸화된 심근세포(AC16)는 멸균 조건에서 AC16 세포 특이적 배양 배양지에서 배양되었습니다. 세포는 5% CO2를 함유한 가습 인큐베이터에서 37°C에서 유지되었습니다. 배양지는 2–3일마다 교체되었고, 최적의 성장 조건을 유지하기 위해 약 70%–80% 합류 지점에서 세포를 통과시켰습니다. 세포 형태와 합류는 각 실험 전에 광학 현미경을 이용해 정기적으로 모니터링되었습니다. 모든 세포 배양 절차는 오염 위험을 최소화하기 위해 생물안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 처리 실험을 위해 AC16 세포를 6웰 플레이트에 시딩하고, 처리 투여 전에 하룻밤 동안 접착하게 했습니다.

11. 정량적 역전사 PCR(RT-PCR)

AC16 세포는 약 60%–70% 합류율에 도달한 후 200 μM 팔미트산(PA) 또는 20 μM 미토탄으로 24시간 처리되었습니다. PA는 소 혈청 알부민(BSA)에 용해되었고, 미토탄은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해되었습니다. 모든 잠재적으로 위험한 시약은 장갑과 실험실 코트 등 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 표준 실험실 안전 절차에 따라 취급되었습니다.

치료 후, 제조사의 지침에 따라 RNase 없는 조건에서 RNA 추출 키트를 사용해 총 RNA를 추출했습니다. RNA 추출 절차는 RNA 분해를 최소화하기 위해 가능한 한 얼음 위에서 수행되었습니다. 후속 분석에는 RNA 농도와 순도가 평가되었고, 이후 분석에는 A260/A280 비율이 1.8에서 2.0 사이의 샘플만 사용되었습니다.

상보적 DNA(cDNA)는 제조사 프로토콜에 따라 역전사 키트를 사용해 합성되었습니다. 이후 실시간 PCR 검출 시스템에서 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 정량적 RT-PCR이 수행되었습니다. 각 반응은 최종 10 μL 용량에서 5 μL SYBR 그린 마스터 믹스, 0.4 μL 전방 프라이머, 0.4 μL 역방향 프라이머, 1 μL cDNA 주형, 3.2 μL 무 뉴클레아제 물을 포함한 용량에서 준비되었습니다. 증폭은 다음과 같은 사이클링 조건에서 수행되었습니다: 95°C에서 초기 변성은 30초, 이어서 95°C에서 5초간 40회 변성, 60°C에서 어닐링/확장으로 30초간 진행되었습니다. 각 실험은 세 개의 생물학적 복제체로 수행되었으며, 모든 반응은 3회로 이루어졌습니다.

GAPDH 가 내부 기준 유전자로 사용되었고, CYP11A1 와 KCNH2 의 상대 mRNA 발현 수준은 2^−ΔΔCt 방법으로 계산하였습니다. 용융 곡선 분석에서 단일 피크가 특정 증폭을 나타낸다고 간주되었습니다. RT-PCR에 사용되는 프라이머 서열은 보충 표 2에 나열되어 있습니다.

결과

멘델 무작위화
약물 투여 가능한 유전자 발현과 HF 간의 인과관계를 평가한 MR 결과는 보충 표 3에 제시되었습니다. FDR 조정 P 값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. HF와 유의미한 인과관계를 가진 총 11개의 유전자가 확인되었습니다(그림 2). 그중 6개 유전자가 HF 위험 증가와 연관되어 있었는데, CDKN1A (P_FDR: 0.03, OR: 1.293), CYP11A1 (P_FDR: 0.034, OR: 1.494), GALT (P_FDR: 0.042, OR: 1.074), KCNH2 (P_FDR: 0.018, OR: 1.163), LST1 (P_FDR: 0.03, OR: 1.112), METRN (P_FDR: 0.018...

토론

이 연구는 MR을 사용하여 약물 투여 유전자가 HF 위험에 미치는 인과관계를 체계적으로 평가하여 8개의 잠재적 치료 표적을 식별하였습니다. 여기에는 네 가지 보호 인자(APOM, CHD4, IL11RA, LPAR5)와 네 가지 위험 요인(CYP11A1, GALT, KCNH2, METRN)이 포함되었습니다. 이러한 연관성은 공존 위치 분석과 SMR에 의해 더욱 뒷받침되었습니다. GO, KEGG 농축, PPI 네트워크 분석을 통한 기능적 주석은 이러한 유전자들이 주로 대사 및 전기생리학과 관련된 경로를 통해 HF에 영향을 미칠 수 있음을 시사했습니다. 더불어, 약물 예측 및 분자 결합 연구는 이러한 표적의 번역 잠재력을 강조했습니다.

APOM은 HF의 보호 인자로 확인되었습니다. APOM은 스핑고신-1-인산(S1P)과 결합하여 TNF-α 발현을 감소시키고, 단핵구-내피 유착을 제한하며, 내피 장벽 무결성을 유지함으로써 항염...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 세포 특이 배양액	HyCyte	TCH-G119
cDNA 역전사 키트	Abclonal	RK20400
CFX96™ 실시간 시스템	Bio-Rad Laboratories
Mitotane	TargetMol	T1199
팔미트산	TargetMol	T2908
RNA 추출 키트	Abclonal	RK30120