마우스 골격근에서 유래한 기능성 미토콘드리아의 분리, 정제 및 특성 분석

요약

트립신 소화와 차동 원심분리를 결합한 표준화된 프로토콜이 생쥐 골격근에서 미토콘드리아의 분리, 정제 및 기능적 특성 분석과 미토콘드리아 이식에서의 적용 평가를 위해 확립되었습니다.

초록

미토콘드리아는 진핵세포에서 에너지 대사, 신호 전달, 세포 항상성을 조절하는 필수 소기관입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 수많은 질병의 발병 기전을 촉진하며, 재생 치료 전략으로서 미토콘드리아 이식의 발전을 촉진했습니다. 미토콘드리아 이식의 성공 적용은 고도로 정제되고 기능적으로 온전한 미토콘드리아의 가용성에 달려 있습니다. 골격근은 높은 미토콘드리아 함량, 대사 활동, 접근성 덕분에 적합한 기증 공급원입니다. 이 연구는 마우스 골격근에서 기능성 미토콘드리아를 분리, 정제 및 특성화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 확립하고, 미토콘드리아 이식에서의 사용을 평가하였습니다. 이 절차는 두 가지 주요 단계로 구성되었습니다. 먼저, 트립신 소화 후 차등 원심분리를 통해 C57BL/6 마우스의 골격근에서 미토콘드리아를 분리하였다. 둘째, 분리된 미토콘드리아를 특성화하여 순도, 초구조 및 기능적 활성을 평가하였습니다. 미토콘드리아 순도는 비신코닉산(BCA) 단백질 정량 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였다. 초구조적 완전성은 투과 전자현미경으로 조사되었습니다. 기능 활성은 JC-1과 미토콘드리아 형광 표지와 함께 고해상도 호흡계를 이용한 산소 섭취량, ATP 생산 능력, 호흡 조절 비율 측정을 통해 평가하였다. 분리된 미토콘드리아는 보존된 막 전위, 온전한 초구조, 안정적인 호흡 활동을 보여 하위 기능 연구와 미토콘드리아 이식 응용에 적합함을 나타냈다.

서론

미토콘드리아는 아데노신 삼인산(ATP) 생성의 주요 부위이며, 세포자멸사, 칼슘 항상성, 그리고 활성산소종(ROS) 대사에 중심적인 역할을 합니다. 따라서 미토콘드리아의 기능적 완전성은 세포 항상성 유지와 세포 운명 결정에 매우 중요합니다 ^1,2. 미토콘드리아 기능장애, 즉 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 돌연변이와 전자전달 사슬(ETC) 이상은 에너지 대사 저하, 산화 스트레스, 세포자사멸사 조절 장애를 초래합니다 ^3,4. 이러한 이상은 유전성 미토콘드리아 질환, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환 등 다양한 질병과 관련이 있습니다 ^5,6. 항산화제나 대사 보조인자와 같은 미토콘드리아 기능 장애에 대한 기존 치료 전략은 미토콘드리아 기능을 직접적으로 회복시키지 않고 증상을 완화하기 때문에 일반적으로 효과가 제한적입니다 ^7,8. 그 결과, 미토콘드리아 이식은 재생 의학에서 유망한 치료법으로 부상했습니다. 이 전략은 손상되거나 기능 장애가 있는 세포에 온전한 외인성 미토콘드리아를 전달하여 미토콘드리아 활동과 세포 에너지 대사를 회복하는 것을 포함합니다 ^9,10. 이전 연구들은 외부 미토콘드리아가 수용 세포에 의해 내화되어 내인성 미토콘드리아 네트워크에 통합될 수 있음을 보여주었으며, 이는 생체에너지 기능 향상과 세포 생존율 향상으로 이어진다 11,12,13.

골격근은 높은 미토콘드리아 함량, 대사 활성, 접근성 때문에 미토콘드리아 분리에 적합한 기증체로 간주됩니다 14,15,16. 미토콘드리아 이식은 미토콘드리아 분리, 정제, 기능적 특성 분석, 그리고 수혜자 세포로의 효율적인 전달 등 여러 중요한 단계를 필요로 합니다. 그러나 지금까지 보고된 프로토콜들 사이에는 상당한 방법론적 변동성이 남아 있으며, 특히 조직 균질화, 효소 소화, 온도 조절 및 정제와 관련된 절차에서 그러합니다. 이러한 변동성은 미토콘드리아의 수율, 순도, 기능적 완전성에 영향을 미쳐 실험적 재현성을 제한할 수 있습니다.

방법론적 일관성과 재현성을 향상시키기 위해, 본 연구는 트립신 소화와 차등 원심분리를 이용해 마우스 골격근에서 기능적 미토콘드리아를 분리하고 특성화하는 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 분리된 미토콘드리아는 비신코닉산(BCA) 단백질 정량화, 웨스턴 블롯팅, 투과 전자현미경, 형광 기반 막 전위 분석, 고해상도 호흡술을 통해 순도, 초구조적 완전성, 기능 활성을 평가하였습니다. 또한, 수혜자 세포가 분리된 미토콘드리아를 흡수하여 미토콘드리아 이식 적용에 적합한지 평가하였습니다. 이 프로토콜은 후속 실험 연구를 위한 기능적 골격근 유래 미토콘드리아를 얻기 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 특정 병원체가 없는 시설에서 수행되었으며, 공군 의과대학 제3부속병원 동물윤리 및 이용 위원회(승인 번호: IACUC-2024kq-065)의 승인을 받았습니다.

수컷 C57BL/6 마우스(6-8주, 18-20g)는 공군 의과대학 실험동물센터(생산 허가: SCXK (Shaanxi) 2024-002)에서 구입하였습니다. 쥐들은 개별 환기된 케이지(IVC)에 양압과 청결한 환경에서 수용되었으며, 온도는 20-26°C, 상대습도는 40%-70%, 12시간의 밝은 어둠 주기, 시간당 최소 15회의 공기 교환이 이루어졌습니다. 멸균된 식단, 식수, 환경 보충이 제공되었습니다.

프로토콜에서 사용되는 시약, 화학물질 및 실험 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 희생 및 조직 채취

1. 쥐를 밀폐된 안락사 챔버에 넣고, 분당 30%-70% 챔버 부피로 점진적으로 이산화탄소(CO₂) 흡입을 통해 안락사시킵니다.
2. 자발적 호흡과 심장 박동 중단, 동공 반사 상실, 기계적 자극에 대한 반응 없음으로 사망을 확인하세요.
3. 안락사된 C57BL/6 쥐를 75% 에탄올에 5분간 담가 소독하세요.
   참고: 알코올로 인한 조직 고정과 세포 손상을 방지하기 위해 담그는 시간을 10분으로 제한하세요. 프로토콜 내내 신선한 조직을 사용하세요. 냉동은 미토콘드리아의 생존력과 기능적 완전성을 저해하기 때문입니다.
4. 쥐를 층류 후드 안에 무균 페트리 접시에 넣고, 복부가 위를 향하게 하여 복부와 뒷다리 부위를 완전히 노출시킵니다.
5. 겸자로 생식기 근처 하복부 피부를 들어 올린 후 작은 절개를 하세요. 피부를 밑 조직에서 분리하기 위해 둔한 해리를 시행하세요. 절개를 중앙선을 따라 발목까지, 그리고 양쪽 뒷다리 쪽으로 측면으로 확장하여 하지근을 완전히 노출시킵니다.
6. 허벅지 앞쪽에 있는 대퇴사두근을 식별하고, 둔한 해리를 사용해 근섬유 방향에 따라 근육을 조심스럽게 분리하세요. 근육 조직을 완전히 분리하기 위해 말위 슬개골 인대와 근위 힘줄을 절단하세요.
   참고: 조직을 미리 냉각된 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 2% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 세척할 때마다 신선한 페트리 접시를 사용해 오염을 최소화하세요.
7. 분리된 근육 조직을 즉시 미리 냉각된 PBS에 넣고 깨끗이 헹구어 조직 표면의 털과 혈액을 제거합니다.
8. 멸균 거즈로 조직의 과도한 수분을 부드럽게 닦아내세요. 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 나누고 샘플을 무게로 재세요. 제제 간 일관성을 유지하기 위해 샘플당 약 100mg의 조직을 사용하세요.

2. 조직 다짐 및 균질

1. Step 1.8 의 조직이 담긴 마이크로 원심분리관을 얼음 위에 올려놓으세요. 멸균 가위를 사용해 조직을 약 1-2 mm³ 크기의 작은 조각으로 갈아냅니다.
2. 0.25% 트립신을 미리 냉각해 8용량을 추가하고, 조직 조각을 얼음 위에서 15분간 소화합니다.
   참고: 조직 질량(1 mg ≈ 1 μL)에 따라 필요한 트립신 부피를 계산하세요. 예를 들어, 조직 80mg에 0.25% 트립신 640 μL을 추가합니다.
3. 혼합물을 1,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상정액은 버리고 조직 펠릿을 남겨두세요. D-만니톨(215 mM), 자당(75 mM), HEPES(20 mM), EGTA(1 mM), 지방산 없는 소 혈청 알부민(0.5% w/v)을 포함한 1 mL 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충제에 재현탁합니다.
4. 현탁을 얼음 위에 유지되는 유리 균질기로 옮기세요. 부탁액이 탁해질 때까지 10-12번의 부드러운 위아래로 스트로크를 사용해 조직을 균질화합니다.
   참고: 균질기 바닥에서 유리 공을 옆으로 회전시키지 마세요. 과도한 기계적 힘은 미토콘드리아 막을 손상시키고 미토콘드리아 기능을 저해할 수 있습니다.

3. 차동 원심분리

1. 균질액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮기고, 1,000 × g 온도에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
2. 상원액을 신선한 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮기고 , 12,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기를 통해 조미건조 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다.
   참고: 1mL 주사기로 상정액을 조심스럽게 채취하며, 펠릿과 잔류 조직 이물질의 교란을 피하십시오.

4. 미토콘드리아 정제 및 저장

1. 조잡한 미토콘드리아 펠릿을 자당(250 mM), HEPES(10 mM, pH 7.4), EGTA(1 mM), 소 혈청 알부민(0.15% w/v)이 포함된 사전 냉각 세척 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다. 서스펜션을 1,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
2. 상청액을 신선한 원심분리관으로 옮기고, 12,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기를 통해 정제된 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다.
   참고: 가능한 한 즉시 신선한 미토콘드리아를 사용하세요. 자당(0.25 M), Tris-MOPS(10 mM, pH 7.4), EGTA(0.1 mM)를 포함한 미토콘드리아 저장 완충 내에서는 4 °C에서의 단기 저장 또는 −80 °C의 장기 저장이 가능합니다. 하지만 냉동은 미토콘드리아 효소 활동과 호흡 기능을 저해할 수 있습니다. 냉동 샘플은 주로 단백질 분석에 사용하세요.

5. 미토콘드리아 및 세포질 단백질 추출 및 BCA 정량

1. 미토콘드리아 단백질 추출
   1. 정제된 미토콘드리아 펠릿을 시작 조직 100mg당 50 μL RIPA 용해 완충제에 재현탁하고, 현탁액을 얼음 위에 15분간 배양합니다.
   2. 용해액을 약 14,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 상청액을 신선한 1.5mL 미세원심분리관으로 옮겨 미토콘드리아 단백질 분획을 얻습니다.
2. 세포질 단백질 추출
   1. 4.2단계에서 12,000 × g에서 4°C에서 15분간 얻은 세포질 상청액을 원심분리합니다. 상청액은 버리고 농축된 세포질 분획으로 펠릿을 유지합니다.
   2. 세포질 펠릿을 50 μL RIPA 용해 버퍼에 재현탁한 후 5.1.1-5.1.2 단계에 설명된 대로 샘플을 처리합니다.
      참고: 용해 완충제는 프로테아제 억제제로 신선히 준비하고, 단백질 분해를 최소화하기 위해 모든 절차를 얼음 위에서 수행하세요. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선하거나 냉동된 것일 수 있습니다.
3. BCA 단백질 정량
   1. 시약 A와 시약 B를 50:1(v/v) 비율로 혼합하여 BCA 작업 용액을 준비합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 200 μL의 작업 용액을 추가합니다.
      참고: 사용 직전에 BCA 작동 용액을 준비하여 상온에서 1시간 이내에 사용하세요.
   2. 소 혈청 알부민(BSA) 정액(2 mg/mL)을 0.5 mg/mL로 희석한 후 사용 전까지 얼음에 보관하세요.
   3. 표준 곡선을 준비하려면 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 또는 0 μL의 BSA 용액을 별도의 우물에 첨가합니다. 최종 부피를 NaCl 용액을 사용해 20 μL로 조절합니다.
   4. 한 세트의 웰에 미토콘드리아 단백질 4 μL과 NaCl 용액 16 μL을 추가합니다. 또 다른 웰 세트에 세포질 단백질 4 μL과 NaCl 용액 16 μL을 추가합니다.
   5. 각 웰에 200 μL BCA 작업 용액을 추가하고, 37°C에서 어두운 환경에서 30분간 배양합니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562nm에서 흡광도를 측정합니다.
   6. 상관계수 (R²)가 0.999≥ 단백질 표준 곡선을 구성합니다. 표준 곡선에서 흡수 값을 보간하여 단백질 농도(μg/μL)를 계산합니다.

6. 골격근 유래 미토콘드리아의 순도 평가

1. 미토콘드리아 및 세포질 단백질 샘플을 최종 농도인 1.5 μg/μL로 희석합니다. 단백질 30 μg와 × 로딩 버퍼 4개를 포함한 20 μL 반응 혼합물을 준비합니다. 남은 양은 NaCl 용액으로 조절하세요. 샘플을 10분간 끓인 후 −80 °C에서 보관하다가 사용하세요.
2. 단백질 샘플은 4%-20% 그라디언트 프리캐스트 젤을 사용해 분리합니다. 140-150V에서 50분간 전기영동을 수행하세요.
3. PVDF 막(0.22 μm)을 메탄올에 1분간 활성화합니다. 400 mA의 빠른 전달 버퍼를 사용하여 30분간 단백질을 전달합니다.
4. 전이 샌드위치에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST에 5분간 세척하세요. 멤브레인을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들며 막을 막으세요.
5. 1차 항체(COX IV, 사이토크롬 c, β-액틴)를 1:1,000 비율로 희석하여 항체 희석 완충액에 넣습니다. 막을 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
6. 멤브레인을 TBST로 세 번, 한 번 10분씩 세척하세요.
7. 2차 항체를 1:10,000 희석한 상태로 실온에서 1시간 배양하세요.
8. 멤브레인을 TBST로 세 번씩 각각 10분씩 세척하세요. 블롯을 현상하고 이미지를 캡처하세요.

7. 골격근 유래 미토콘드리아의 미토트래커 염색

1. 사용 직전에 염색 작업 용액을 미리 가열된 매체에서 최종 농도인 200 nM로 희석하세요.
2. 미토콘드리아 펠릿을 작업 용액 100 μL에 다시 현탁한 후 37 °C에서 어두운 곳에서 20분간 배양합니다.
3. 배양 후 5용량의 미리 냉각된 저장 버퍼를 추가하세요. 현탁액을 12,000 × g에서 4 °C에서 10분간 원심분리하고, 결합되지 않은 염료가 포함된 상청액을 버립니다.
4. 염색된 미토콘드리아 현탁액의 알리코트를 유리 슬라이드에 옮기고 샘플을 커버슬립으로 덮습니다.
5. 적색 형광 미토콘드리아 염료 검출을 위해 적절한 여기 및 방출 설정을 갖춘 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 포착합니다.

8. JC-1 염색을 이용한 미토콘드리아 막 전위 평가

1. CCCP(카보닐 시안화물 m-클로로페닐 하이드라존) 처리 그룹
   1. 미토콘드리아 현탁액을 CCCP로 최종 농도 10 μM로 처리하고 20분간 인큐브하여 미토콘드리아 막 전위를 소산시킵니다.
   2. CCCP 처리된 미토콘드리아 현탁액을 37°C에서 250μL JC-1 염색액과 함께 20분간 부드럽게 교반하여 인큐베이팅합니다.
2. JC-1 처리 그룹
   1. 미토콘드리아 펠릿을 100 μL JC-1 작업 용액에 재현탁한 후 37°C에서 빛을 차단한 상태로 20분간 배양합니다.
   2. 5× 정액을 증류수와 2:8(v/v) 비율로 희석하여 1× JC-1 착색 버퍼를 준비하고, 얼음 위에 유지하세요.
   3. 염색 용액을 제거하고 미토콘드리아 펠릿을 미리 냉각된 1× JC-1 염색 버퍼로 두 번 세척합니다.
   4. 염색된 미토콘드리아를 PBS에 재현탁하고 레이저 스캐킹 공초점현미경으로 영상을 찍습니다. 녹색 형광 JC-1 단량체와 적색 형광 JC-1 집합체를 검출하기 위해 적절한 여기 및 방출 설정을 사용하세요.

9. 투과 전자현미경을 이용한 분리된 골격근 미토콘드리아의 초구조적 분석

1. 갓 분리된 미토콘드리아를 0.2M 인산염 완충제(pH 7.4)에 2.5% 글루타알데히드에 고정하고, 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
2. 샘플을 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 1% 오스뮴 테트록사이드에 실온에서 1시간 동안 고정합니다.
3. 샘플을 등급 에탄올 시리즈로 탈수한 후 에폭시 수지에 침투, 임베딩, 중합합니다.
4. 울트라미세톰을 사용해 50-70 nm 두께로 삽입된 샘플을 절개합니다.
5. 구간은 우라닐 아세테이트와 시트레이트 납으로 이중 염색하세요. 투과 전자현미경을 사용해 샘플을 관찰하고 영상으로 촬영하세요.

10. 골격근 유래 미토콘드리아의 세포 흡수

1. 문화 NCTC 클론 929 (L929; RRID: CVCL_0462상업 공급자로부터 얻은 세포, MEM 알파 함유 배지에 태아 소 혈청 10%와 페니실린-스트렙토마이신 1%를 보충한 상태입니다.
2. 세포가 80%-90% 합류에 도달하면 배지를 흡입하고 미리 가열한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 트립신-EDTA를 추가하고 세포가 분리될 때까지 배양합니다.
3. 완전한 배지를 첨가하여 소화를 종료하고 부드러운 피펫팅으로 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 현탁액을 1,000 × g에서 5분간 원심분리한 후 상상액을 버립니다.
4. 세포 펠릿을 신선한 완전 배지에 재현탁한 후 적절한 밀도로 새로운 배양 접시에 씨앗을 심습니다. 세포를 5% CO₂가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 배양합니다.
5. 씨앗 통과 5(P5) 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 밤새 배양합니다.
6. 분리된 미토콘드리아를 37°C의 어두운 환경에서 미토콘드리아 특이적 적색 형광 염료로 표지하고, PBS로 미토콘드리아를 세척하여 결합하지 않은 염료를 제거합니다.
7. 적색 형광 염료 표지된 미토콘드리아(각 배시당 20 μg 미토콘드리아 단백질)를 세포에 첨가하고, 5% CO₂를 함유한 가습 환경에서 37°C에서 24시간 배양합니다.
8. 형광 액틴 프로브로 세포를 30분간 염색하여 액틴 세포골격을 시각화하고, 형광 핵염료로 핵을 반염색합니다.
   참고: 동복 기간 동안 혈청 농도를 신중히 조절해야 하며, 과도한 혈청은 미토콘드리아 흡수 효율을 저하시킬 수 있습니다. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선합니다.

11. 고해상도 호흡계를 이용한 미토콘드리아 호흡 기능 측정

1. 기기 준비
   1. 호흡실, 전극 구획, 마개를 청소하세요.
   2. 각 챔버에 자기 교반봉을 넣고 산소 전극막의 무결성을 확인하세요.
2. 계측기 교정
   1. 각 호흡실에 미토콘드리아 호흡 완충제(MiR05, pH 7.10)를 2.1mL 넣고 기포가 없도록 하세요.
   2. 산소 기준선이 안정화된 후 37°C에서 30분간 고해상도 호흡계를 평형으로 유지하고, 매일 공기 보정을 수행합니다.
      참고: 산소 전극 신호를 방해하고 데이터 품질을 저하시킬 수 있으므로 공기 방울을 호흡실에 주입하는 것을 피해야 합니다. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선합니다.
3. 시료 부하와 평형
   1. 약 30 μg의 단백질을 포함한 갓 분리된 미토콘드리아를 호흡실에 넣고 챔버를 밀봉합니다.
   2. 챔버를 5-8분간 평형으로 유지하고 기초 산소 소비량을 기록하세요.
      참고: 미토콘드리아를 얼음 위에 보관하고 격리 직후 호흡 측정을 수행하여 활성을 유지하세요.
4. SUIT 프로토콜
   1. 피루브산 5 μL (2 M), 글루타메이트 10 μL (2 M), 말레이트 10 μL (400 mM)를 순차적으로 첨가합니다. 반응을 5분간 안정시키고 CI 누출 호흡을 기록하세요.
   2. 10 μL ADP(500 mM)를 첨가하여 산화적 인산화를 유도하고 CI OXPHOS 호흡을 기록합니다. 10 μL 염화마그네슘(0.3 M)을 추가합니다.
   3. 20 μL 석시네이트(1 M)를 추가하고 안정화 후 CI+CII OXPHOS 호흡을 기록합니다.
   4. 2 μL ATP 합성효소 억제제(0.01 mM)를 추가하고 양성자 누출 호흡을 기록합니다.
   5. CCCP(1 mM)를 2분 간격으로 3회 2 μL 단위로 점진적으로 추가하여 산소 소비량이 정체에 도달할 때까지 추가합니다. 최대 전자 전달 시스템 용량을 기록하세요.
   6. 복합체 I 활성을 억제하기 위해 1 μL 로테논(1 mM)을 추가합니다.
   7. 복합체 III 활성을 억제하고 잔류 산소 소비량을 기록하기 위해 1 μL 항마이신 A(5 mM)를 추가합니다.
   8. 5 μL 아스코르베이트(800 mM)와 5 μL N,N,N',N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민(200 mM)을 추가합니다. 안정화 후 최대 복합 IV 호흡 활동을 기록합니다.
      참고: 냉동 전에 모든 시약을 분리해 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요. 과도한 분리는 미토콘드리아 호흡을 억제하므로 CCCP를 점진적으로 추가하세요.
5. 데이터 분석
   1. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 CI 누출, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII 누출, CI+CII ET, CII ET, CIV 등 미토콘드리아 호흡 매개변수를 얻습니다.
   2. 호흡 조절 비율(RCR; 상태 3 호흡/상태 4 호흡) 및 ATP 생산 능력. 통계 분석을 위해 모든 값은 세 개의 유의한 숫자까지 유지하세요. 데이터 분석에 사용된 소프트웨어는 Oroboros Datlab 8(Oroboros Instruments)이었습니다.

결과

미토콘드리아 분리 및 정제 작업 흐름의 개략 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 모든 시술은 미토콘드리아의 완전성과 기능 기능을 유지하기 위해 4 °C에서 시행되었습니다. 신선하게 분리된 골격근 조직은 트립신과 함께 잘게 썰어 조직 해리를 촉진한 후, 유리 호모제이저를 이용해 등장성 격리 완충제에서 균질화했습니다. 이후 미토콘드리아를 조직 잔해 및 세포질 오염물질에서 분리하기 위해 차별 원심분리가 시행되었습니다. 초기 원심분리는 1,000 × g에서 핵과 큰 잔해를 제거했으며, 이후 12,000 × g에서의 원심분리는 조잡한 미토콘드리아 펠릿을 얻었다. 추가적인 세척 및 원심분리 단계를 통해 세포질 오염이 더욱 줄어들어 정제된 미토콘드리아가 생성되었으며, 이는 하위 구조 및 기능 분석에 적합한 것입니다(그림 1).

토론

미토콘드리아 이식은 세포 치료와 재생의학에서 신흥 전략으로, 기능적으로 온전한 미토콘드리아를 전달하여 에너지 대사가 저하된 세포의 생리적 기능을 회복합니다. 세포 에너지 대사를 조절하는 것 외에도, 이 기술은 세포자멸사(apoptosis)와 산화 스트레스(oxiative stress)와 같은 주요 생물학적 과정을 조절하여 다양한 질병에 대한 새로운 치료 기회를 제공합니다. 그러나 미토콘드리아 이식의 임상 번역은 여전히 여러 도전에 직면해 있는데, 그중 하나는 표준화되고 효율적이며 재현 가능한 미토콘드리아 분리 프로토콜의 부재로, 이는 여전히 주요 병목 현상입니다.

이 문제를 해결하기 위해, 본...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	미토콘드리아 특성화
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	형광 염료의 광 퇴색 감소
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	단백질 농도 분석
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	분리된 미토콘드리아의 순도 검출에 사용된 Beta-actin antibody
BSA	Sigma	A6003	분리 과정에서 미토콘드리아 활성을 보호하기 위해 자유 지방산을 결합합니다.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C 원심분리
CCCP	Solarbio	C6700	미토콘드리아 산화 인산화의 얽힘을 해제하고 최대 양성자 누출을 유도
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	면역형광 염색 관찰
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	미토콘드리아 특성화
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	핵 반염색
D-mannitol	Solarbio	IM00402	분리 중 삼투압 균형 유지 및 미토콘드리아 부종 방지
EGTA	Sigma	E4378	미토콘드리아 분리 완충액에서 일반적으로 사용되며 특히 Ca2+를 결합하여 미토콘드리아 기능을 보호
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	L929 세포 배양
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	조직을 잡고, 보유하고, 들어 올리는 데 사용
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	조직 균질화 및 미토콘드리아 분리에 사용
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	단백질을 가교하여 세포 초미세 구조를 빠르게 고정하고 안정화하여 자가분해를 방지하고 소기관의 자연 형태를 보존
HEPES	Thermo Fisher	J67485	안정된 pH 환경 제공
Incubator	Thermo Fisher	51032874	L929 세포 배양
JC-1	Solarbio	M8650	정제된 미토콘드리아의 막 전위 변화 검출.
L929 cell line	Procell	CL-0137	미토콘드리아 내이동 분석용
Lead citrate	Sigma	15326	미세 세포 하부 구조 관찰을 위한 초박 단면의 염색
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	L929 세포 배양
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	전이 버퍼의 구성 요소로서, SDS를 제거하고 젤에서 고체 상태 멤브레인으로의 단백질 전이를 용이하게 하는 데 사용
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	JC-1 염색된 미토콘드리아의 흡광도 측정
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	골격근의 미토콘드리아 막 전위 검출
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	차등 원심분리 기반 추출용 키트
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	미토콘드리아 보존용
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	미토콘드리아 특성화
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	용액 준비 시 완충액으로 사용
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001은 웨스턴 블롯에서 마우스 IgG (H+L)를 표적으로 함
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001은 ELISA 및 웨스턴 블롯에서 토끼 IgG (H+L)를 표적으로 함
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	주로 막의 비특이적 결합 부위를 차지하여 배경 신호를 감소시키는 차단제로 사용
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	미토콘드리아 호흡 기능 및 산소 대사 결정
Osmium tetroxide	Sigma	75633	지질을 보존하고 TEM 샘플에서 멤브레인 대비를 향상시키는 후 고정
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	근육 조직 세정
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	L929 세포 배양
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	형광 현미경 이미징을 위한 세포골격 F-actin