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IGT의 동물과 모델
모든 동물 시술은 동남대학교 쑤저우연구소 동물윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. SEU-IACUC-20250318007)에서 실험동물의 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 쥐들은 25°C의 특정 병원체 무(SPF) 조건에서 12시간 빛, 12시간 암 주기로 보관되었습니다. 마취가 필요한 시술에서는 유도 챔버를 통해 산소로 투여된 이소플루란으로 쥐를 마취하고 코 콘으로 유지했습니다. 이소플루란은 유도 시 3%, 유지 시 1%로 사용되었으며, 농도는 호흡 심수와 시술 반응에 따라 조정되었습니다.
바늘 삽입이나 주사 전에 올바른 반사 상실과 발가락 집힘에 대한 반응 부재로 충분한 마취 깊이가 확인되었습니다. 마취 중에는 호흡 패턴, 신체 자세, 회복 상태를 모니터링했으며, 동물들은 체온을 유지하기 위해 온열 패드 위에 올려놓았습니다. 동물들은 우리당 2마리씩 수용되었으며, 혈당 검사를 위해 금식이 필요하지 않은 한 자유롭게 음식과 물을 사용할 수 있었습니다. 도착 후 쥐들은 모델 유도 전 1주일간 고대에 적응시켰습니다. 동물 복지는 매일 모니터링되었으며, 일반 활동, 미용, 음식 섭취, 체중, 주사 부위 상태, 마취 후 회복 등이 포함되었습니다. 연구가 끝난 후, 쥐들은 승인된 동물 프로토콜에 따라 안락사되었습니다. 안락사는 점진적으로 CO₂ 흡입을 통해 시행되었으며, 이후 자궁경부 탈구법으로 사망 확인이 이루어졌습니다. 심각한 체중 감소, 지속적인 움직임 정지, 비호흡, 식사 및 마실 수 없는, 심각한 고통 등 인도적 평가 기준을 충족하는 동물들은 예정된 종료점까지 유지하지 않고 즉시 안락사되었습니다. 이 연구에는 체중 200± 20g의 특정 병원체가 없는 수컷 Sprague–Dawley 쥐가 사용되었습니다. 1주일간의 적응 후, 쥐들은 무작위로 두 그룹으로 배정되었습니다: 정상군의 3마리는 정상적인 음식을 먹였고, 모델 그룹의 20마리는 3주간 고지방 차우(50% 기초 차우 + 10% 라드 + 25% 자당 + 15% 노른자 가루)를 먹였습니다. 모델 그룹의 동물들은 12시간 동안 수분 제한 없이 금식 후 12시간 동안 20mg/kg의 2% STZ 용액(0.1mol/L, pH 4.4 시트레이트 버퍼에 용해됨)을 복막 내 주사를 받았습니다. 정상군은 정상 음식을 먹은 후 해당 용량의 시트레이트 완충액 복강내 주사를 받았습니다. 1주 후 복강내 포도당 내성 검사(IPGTT)가 시행되었습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비 는 재료표에 나열되어 있습니다.
공복 혈당(FPG)은 각 그룹의 쥐 꼬리 끝에서 수분 제한 없이 12시간 금식 후 혈액 채취로 측정했으며, 복강내 주사 후 2시간 동안 20% 포도당 2g/kg 주사 후 2hPG가 기록되었습니다. 정상 그룹에서는 FPG 범위가 5.1–6.6 mmol/L, 2hPG 포도당 범위는 7.3–9.4 mmol/L였으며, 모델 그룹에서는 FPG가 ≤7.0 mmol/L, 2hPG 범위는 10–16 mmol/L이었습니다. IGT 모델 유도에 배정된 20마리 중 18마리가 IPGTT 후 사전 정의된 IGT 기준을 충족하여 후속 중재 실험에 포함되었습니다. 두 마리의 쥐는 FPG 또는 2hPG 값이 미리 정의된 IGT 범위를 벗어나 제외되었습니다. 18마리의 적격 쥐는 고지방 식단과 정상 식단에 무작위로 배정되었으며, 각 그룹에 9마리씩 배정되었습니다. 각 식이군은 추가로 세 개의 하위 그룹으로 나뉘었는데, 침 지점 비틀기, 비침 부위 비틀기, 침 지점 직접 삽입 그룹으로, 각 하위군마다 3마리의 쥐가 있었다. 이 연구는 침술 중재와 SERS 기반 비율 추적을 전임상 IGT 쥐 모델에서 결합하는 타당성을 평가하기 위해 고안된 탐색적 방법 개발 연구였습니다. 공식적인 통계적 검정력 계산은 수행되지 않았습니다. 세 마리의 쥐 하위 그룹은 타당성, 예비 SERS-마이크로바늘 연구, 동물 감소 원칙을 바탕으로 선정되었습니다. 쥐는 실험자가 무작위로 배정했으며; 공식적인 배분, 은폐, 눈 가리기는 시행되지 않았다.
침술 치료 프로토콜은 전통 중의학의 근거 기반 임상 실무 지침과 동물 실험의 타당성을 참고하여 선별되었다22. 선정된 경혈은 중완(RN12/CV12), 수이펀(RN9/CV9), 음교(RN7/CV7), 양측 천서(ST25), 양측 수이도(ST28), 양측 조산리(ST36)였습니다. RN12, RN9, RN7은 전측 정중선에 위치하며 단일 중앙선 점으로 처리되었고, ST25, ST28, ST36은 양측으로 치료되었습니다. 침술 지점 조합은 IGT23 임상 치료에 사용된 기준을 기반으로 하였습니다. 적응은24,25 문헌에 기반하며, 이분법을 사용했다. 쥐의 경우, 경혈점은 해부학적 랜드마크와 표준 인간 경병점 위치와의 비례 변환에 따라 국소화되었습니다. 복부 RN/CV 지점은 첨골돌기, 배꼽, 치골 결합을 통해 해부학적 랜드마크로 확인되었습니다. ST25는 배꼽 부위에서 양측으로, ST28은 전방 정중앙선에서 같은 외측 거리의 하복부 부위에 양측적으로 표시되었습니다. ST36은 경골결절 외측의 전경골 전부 부위에서 확인되었다. 인접한 비침술 비교 부위는 해당 경보에서 5mm 떨어진 경경선 외곽에 표시되었으며, 눈에 보이는 혈관, 흉터, 이전 천자 부위는 피하였습니다. 바늘링 전에 승인된 동물 프로토콜에 따라 이소플루란으로 마취한 쥐를 보온용 패드 위에 엎드려 눕혔습니다. 각 표적 부위의 복부와 뒷다리 피부는 면도하고 75% 에탄올로 소독되었습니다. SERS 활성 마이크로바늘은 피부에 수직으로 약 10mm 깊이까지 삽입되었습니다. 침 점이 있는 비틀기 그룹에서는 SERS 활성 미세바늘을 선택한 경혈에 삽입하고 20분 동안 부드럽게 양방향으로 회전시켰습니다. 비침술 부위 그룹에 대해서도 5mm 인접한 비침술 비교 부위에서 동일한 시술이 시행되었습니다. 직접 삽입 그룹에서는 SERS 활성 마이크로바늘을 경보에 삽입하고 20분간 비틀지 않고 유지했습니다. 모든 니들링 절차는 동일한 훈련된 조작자가 수행하여 운영자 간 변동을 최소화했습니다.
니들링은 하루 2회, 10:00과 15:00에 7일 연속으로 시행되었습니다. 매일 시술 전, 수분 제한 없이 8시간 금식 후 FPG를 측정했습니다. 매일 바늘 시술 후에는 OC 및 RP 반응을 기록했습니다. 침술 치료 후 7일째에 IPGTT가 시행되었고, 2hPG 수치가 기록되었습니다.
주의사항
스트렙토조토신은 위험하므로 독성 화학물질로 취급해야 합니다. 실험실 코트, 니트릴 장갑, 보호 안경, 마스크를 착용한 상태에서 화학 연기함이나 인증된 생물안전 캐비닛에서 스트렙토조토신 용액을 준비하세요. 스트렙토조토신 오염된 주사기, 주사기, 물티슈, 침구, 케이지, 동물 관련 배설물은 기관의 유해 생물학적 및 화학적 폐기물 절차에 따라 처리되어야 합니다. 사용한 바늘과 주사기는 즉시 뚜껑을 닫지 않고 찌름에 강한 샤프 용기에 버려야 합니다.
OC 및 RP 검출을 위한 SERS 활성 마이크로니들 제작
침 바늘은 이전에 보고된 대로26명을 준비했다. 연구 기간 내내 동일한 종류의 상업용 스테인리스 침술 침(0.25mm × 26mm)을 사용하여 SERS 활성 마이크로바늘을 제작하였습니다. 바늘은 피부에 대략 수직으로 깊이 10mm로 삽입되었습니다. 트위스티싱 그룹의 경우, 동일한 훈련된 조작자가 유지 기간 동안 20분 동안 부드럽고 일관되게 수동 양방향 회전을 적용했습니다. 조작은 기기 제어가 아니었으며; 따라서 정확한 회전 주파수와 진폭은 정량화되지 않았습니다. 이 한계는 토론에서 인정되었습니다.
초기에는 바늘을 MMA에 담갔다가 실온(25°C)에서 1일간 건조시켰습니다. 다음으로, PMMA 보호층에 크기와 모양, 깊이가 비슷한 두 개의 평행한 홈(5mm 간격)을 에탄올로 세척한 작은 공예용 칼날을 사용해 만들었습니다; 그 후 바늘을 0.5M 황산에 담가 전해질 역할을 하며 10초 동안 12V 전압에서 전기화학 식각을 거쳐 점수 부위에 거의 원형에 가까운 두 개의 홈을 형성했습니다. 셋째, 세 차례 세척 후 바늘을 0.1 mol L−1 MPTES와 0.3 mol L−1 APTES가 포함된 에탄올 용액에 실온에서 24시간 담가, 이로써 홈이 있는 표면에 설피드릴 기능을 부여했다. 넷째, 바늘을 MMA에 담가서 코팅을 벗겼습니다. 이전에 보고된 방법27을 기반으로 산화환원 반응성 SERS 활성 마이크로바늘을 준비하였습니다. SERS 기판은 각 침술 바늘의 각각 홈 중 하나에 흡착되고, 생성된 SERS 활성 미세바늘은 1 × 10-4 mol/L 농도로 37 °C에서 60분간 수용성 p-PDA 용액에 담근 후 산화 반응성 SERS 활성 미세바늘을 생성했습니다. 금 나노쉘을 기반으로 한 SERS 기질은 앞서 설명한 대로 합성되었습니다. 본 연구에서는 이 미세바늘들을 각 침술 바늘의 다른 홈에 떨어뜨린 후 자연스럽게 건조시켰다. 이로 인해 OC 및 RP 반응을 가진 SERS 활성 마이크로바늘이 탄생했습니다.
SERS 활성 마이크로바늘에 대한 OC 및 RP 반응의 체외 평가
OC 및 RP 프로브의 반응은 SERS 활성 마이크로바늘을 체외 조직에 삽입하여 평가하였다. OC 프로브의 산화 반응성을 검증하기 위해 산화 전후로 p-PDA의 SERS 스펙트럼을 기록하였습니다. 산화환원 SERS 프로브의 스펙트럼도 강환원 NaBH4 용액과 강산화성 HAuCl4 용액에서 획득하였습니다. OC 프로브의 선택성은 10-4 M FeSO4 1×, 10-4 M Na2SO4, 10-4 M ×× 10-4 M 아스코르브산 1× 등 환원제와 산화제(10-4 M CuSO4, 10-4 M H2O2, 10-4 M ×× FeCl3 1 포함)를 사용하여 평가되었습니다. 그리고 10-4 M HAuCl4× 1척. 모든 용액은 20 mM PBS(pH 7.4)에서 준비되었고, 각 용액과 함께 37 °C에서 20분간 배양되었습니다. SERS 활성 마이크로니들의 견고성은 1× 10-4 mol/L FeCl3로 반응 전후 OC 반응을 기록하여 평가하였다. 이러한 외부 체외 및 용액 기반 검사는 통제된 조건에서 탐침 반응성을 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 국소 pH 변화, 단백질 흡착, 세포외 기질 구성 요소 및 기타 생물학적 물질이 SERS 신호에 영향을 미칠 수 있는 생체 내 조직 미세환경의 복잡성을 완전히 재현하지는 못합니다. 따라서 생체 내 OC 및 RP 측정값은 기질 독립적인 생화학적 측정이 아닌 상대적으로 산화환원 관련 SERS 지수로 해석되었습니다.
침술 및 비침술 부위에서의 OC 및 RP 탐지
침술 지점과 비침술 지점에서 OC 및 RP 탐침의 성능을 평가하기 위해, SERS 활성 마이크로바늘을 건강한 쥐의 ST36 및 RN12 침술 지점에 각각 인접한 약 10mm 깊이에서 동일한 시간 삽입했습니다.
바늘 꼬임이 OC 및 RP 감지에 미치는 영향
다양한 침술 기법 하에서 OC 및 RP 탐침의 반응성을 평가하기 위해, 건강한 쥐의 ST36 및 RN12 침술 지점과 인접한 약 10mm 깊이에 SERS 활성 마이크로바늘을 삽입하였다. 각 침 지점마다 한 바늘이 비틀렸고, 인접한 침은 비틀리지 않았으며, 반대로 침 지점 인접 바늘은 비틀렸지만 침 지점에 있는 바늘은 비틀리지 않았습니다. 각 침에 대해 동일한 삽입 시간에 프로브에서 나오는 SERS 신호가 수집되었습니다.
IGT 환자 쥐에서 침 지점, 바늘 꼬기, 식이 조건에 따른 OC 및 RP 변화
침 치료, 바늘 꼬기 치료, 식이 상태가 IGT 쥐의 OC 및 RP에 미치는 영향을 평가하기 위해, 고지방 식이군 쥐는 무작위로 세 그룹(A1, A2, A3; 각 그룹에 3마리씩)으로 배정되었고, 정상 식이군(그룹: B1, B2, B3; 각 그룹에 3마리씩)도 포함되었다. A1 및 B1 그룹의 쥐에서는 진정 후 침술 지점에 SERS 활성 미세바늘을 삽입하고 20분간 비틀었으며; 동일한 절차가 A2 및 B2 그룹의 쥐에 대해서도 시행되었으나, 미세바늘은 침술 지점 인접 5mm 간격으로 삽입되었다. A3 및 B3 쥐의 경우, SERS 활성 미세바늘을 쥐 침술 지점에 비틀지 않고 삽입했습니다; 바늘은 20분 동안 그대로 두었습니다. 니들링은 7일 동안 하루 10시와 15시에 두 번 시행되었습니다. 매일 시술 전에는 혈당 측정기를 사용해 각 쥐 그룹의 FPG 값을 기록했습니다(단식 후 8시간 동안 물 제한은 없었습니다). 매일 침질 후 OC와 RP 반응을 측정하고 기록했습니다. 7일째 침술 후 각 쥐 그룹에 대해 IPGTT를 시행하고 2hPG 수치를 기록하였다.
특성화 및 측정
SERS 활성 마이크로니들의 형태는 주사 전자현미경(SEM)으로 조사되었습니다. SERS 스펙트럼은 25°C에서 50× 장거리 대물렌즈(NA: 0.5)와 785 nm 레이저를 장착한 라만 분광기를 사용해 획득했습니다. 모든 측정에서 획득 시간은 10초였으며, 라만 시스템은 동일한 광학 구성에서 명목상 레이저 출력 600 μW로 작동했습니다. 이 연구에서는 조직 표면에 전달된 실제 레이저 출력을 직접 측정하지 않았습니다. 따라서 동일한 획득 환경에서 그룹 간 상대 비교를 위해 SERS 스펙트럼을 사용했으며, 절대 조직 광열 안전성에 관한 결론은 도출되지 않았습니다. 두 SERS 프로브의 강도 비율은 다음과 같은 방법으로 계산되었습니다: 1450 cm−1 에서의 강도 값과 1500 cm−1 의 강도 값을 OC 지표로 지정했으며(I1450 cm−1/I1500 cm−1), 각 피크 각각에서 1700 cm−1 (배경 값)에서 강도를 빼고 나서, 각각 이전 보고서와 마찬가지로 17명; 그리고 RP의 지표로 I1606 cm−1 / I1666 cm−1 을 사용하여 각각 두 피크 각각에서 1700 cm−1 (배경)에서의 강도를 차감했다. 계산된 I1450 cm−1/I1500 cm−1 과 I1606 cm−1/I1666 cm−1 값은 각각 상대적으로 SERS 유도 지수로 분석되었으며, 이는 OC 및 RP 관련 반응의 상대적 지수였습니다. 이 비율들은 동일한 획득 환경에서 그룹 및 시점 간 변화를 비교하는 데 사용되었습니다.
본 연구에서는 이러한 비율을 산화성 종의 절대 농도나 절대적인 전기화학 산화환원 전위값으로 변환하는 외부 보정 곡선이 설정되지 않았습니다. 각 스펙트럼은 SERS 탐사선의 다섯 개 지점에서 세 번의 복제 샘플에서 두 번 기록되었습니다. Origin은 데이터를 처리하고 차트를 만드는 데 사용되었습니다. 획득 관련 변동성을 최소화하기 위해 동일한 레이저 파장, 대물, 획득 시간, 레이저 출력 설정, 스펙트럼 처리 워크플로우가 모든 그룹에 적용되었습니다. 레이저 조사로 인한 잠재적 광열 또는 광화학 효과는 독립적으로 정량화되지 않았으며, 한계로 인정받고 있습니다. 통계 데이터는 평균± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. 각 실험이나 도표 패널에 사용되는 표본 크기와 통계적 검정은 해당 도표 전례에 명시되어 있습니다. 체 외 탐침 검증 실험에서는 SERS 프로브 또는 독립적으로 준비된 마이크로니들(microneedle)을 분석 장치로 사용했습니다. 생 체 내 혈당 및 SERS 지수 분석에서는 쥐를 생물학적 분석 단위로 사용했습니다. 동일한 프로브의 여러 지점에서 수집된 스펙트럼은 기술적 측정으로 간주되어 그룹 수준 분석 전에 평균을 내었습니다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 그룹 간 비교는 해당 도표 판례에 표시된 통계 검정을 사용하여 수행되었습니다. 7일간의 중재 기간 동안 연속 공복 혈당 및 SERS 지수 측정은 소그룹 규모로 인해 탐색적 종단 추세로 해석되었으며, 공식적인 반복 측정이나 혼합 효과 모델은 적용되지 않았습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.