측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

C. elegans의 수명을 측정하기 위해, 시간차 산란법을 사용하여 연령이 동기화된 집단을 생성합니다. 활동성 있는 성체 자웅동체 벌레를 UV로 사멸시킨 E. coli가 도말된 nematode growth media(NGM) 플레이트로 옮겨 6~8시간 동안 알을 낳게 한 후 제거합니다. 이후 이틀 동안 알에서 벌레가 부화하여 L4 유충 단계까지 성장합니다. L4 벌레를 살아있는 박테리아의 오염을 방지하기 위한 ampicillin과 생식을 억제하기 위한 FUDR이 포함된 새로운 NGM 플레이트로 옮겨 성체로 발달하도록 합니다.

이 시점부터 모든 벌레가 죽을 때까지 2~3일마다 성충을 관찰합니다. 각 시점마다 죽은 벌레를 플레이트에서 제거하고, 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수를 기록합니다. 저는 워싱턴 대학교 병리학과의 Matt Capline 연구실 소속 George Seton입니다.

오늘은 수명을 측정하는 방법과 이를 통해 확인한 C. elegans의 간염 상태를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 노화의 유전학을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

기초적인 수명 실험에는 두 종류의 플레이트가 필요합니다. 첨가물이 없는 표준 NGM 플레이트와, NGM에 ampicillin 및 fluoro deoxy uridine이 모두 첨가된 AMP FUDR 플레이트입니다. 두 종류의 플레이트 모두 e coli OP 50 박테리아를 도말한 후, uv 노출을 통해 박테리아를 사멸시킵니다. 먼저 10 milliliters의 NGM 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.

60 mm 페트리 접시당 고체 NGM을 전자레인지의 고출력 모드에서 32초 간격으로 가열하여 완전히 녹입니다. 가압된 가스 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 가열 단계 사이에 배지를 흔들어 줍니다. 액체 상태의 NGM을 55 °C 항온수조에 넣거나 벤치 위에 두어 배지를 냉각시킵니다. 배지가 55 °C까지 식어 유리 용기를 맨손으로 편하게 잡을 수 있게 되면, 약물을 첨가할 준비가 된 것입니다.

약물이 포함된 플레이트를 제조하려면, NGM 100 mL당 150 mM FUDR 33 µL와 100 mg/mL Ampicillin 100 µL를 첨가하고 소용돌이치듯 섞어줍니다. Ampicillin은 외부 박테리아 오염을 방지하기 위해 사용하며, FUDR은 알의 부화를 막기 위해 사용합니다. 따라서 성장하는 유충으로부터 성충을 분리하기 위해 며칠마다 웜을 옮겨줄 필요가 없습니다.

이제 배지를 붓고 플레이트를 벤치 위에서 이틀 동안 건조합니다. 플레이트 건조가 완료되기 전날, LB agar 플레이트에 신선하게 스트리킹한 e coli OP 50 박테리아의 단일 콜로니를 사용하여 액체 LB 배양액을 접종합니다. 60 mm 플레이트당 최소 0.5 milliliter의 배양액을 준비하십시오.

OP 50 배양액을 37 °C 셰이커에 넣고 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 3,500 g의 원심력으로 10분 동안 원심 분리하여 OP 50 박테리아를 펠렛화합니다. 박테리아를 10배 농도로 재현탁할 수 있을 만큼 상층액을 데칸테이션하여 제거합니다.

이제 각 플레이트에 농축된 배양액 100 µL를 접종합니다. 피펫 팁이 NGM 표면에 닿지 않도록 주의하십시오. 배지 표면에 흠집이 생기면 벌레가 그 속으로 파고들 수 있기 때문입니다. 박테리아가 플레이트 벽면에 닿지 않으면서 NGM의 중앙 영역을 덮을 때까지 플레이트를 회전시킨 후, 벤치 위에서 24시간 동안 건조시킵니다. 건조가 완료되면 박테리아 성장을 억제할 수 있을 만큼 충분한 강도의 UV 선량을 플레이트 표면에 조사합니다. 본 실험에서는 StrataGene UV Straddle Linker 2,400을 사용합니다.

먼저 뚜껑을 제거한 플레이트를 스트래들 링커(straddle linker)에 로딩하십시오. 그런 다음 energy 버튼을 누릅니다. 키패드에 9 9 9 9를 입력하고 start 버튼을 누르십시오.

플레이트를 약 5분 동안 UV에 노출시킵니다. UV로 박테리아를 사멸시킨 플레이트는 4°C에서 뒤집은 상태로 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 이 섹션에서는 부화 날짜가 동일한 벌레 집단을 생성하는 방법을 설명합니다.

먼저 약 20마리의 젊은 성체 벌레를 약물이 포함되지 않은 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 벌레가 증식하고 일주일 이내에 모든 박테리아 먹이를 다 먹을 수 있도록 플레이트를 25 °C에서 약 일주일 동안 둡니다. 성장이 정지된 dower 단계의 갓 부화한 벌레들이 나타나면, 20~30마리의 dower 유충을 약물이 없는 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 먹이가 있는 상태에서 25 °C로 배양합니다.

dower 유충은 2일 이내에 생식 능력이 있는 성체로 성장하며, 이후 며칠 동안 생식 능력을 유지합니다. 이제 생식 능력이 있는 성체 10~15마리를 약물이 포함되지 않은 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다. 이 플레이트를 시간별 산란 또는 TEL 플레이트라고 합니다.

충이 알을 낳을 수 있도록 TEL 플레이트를 25 °C에 둡니다. 이 알에서 부화한 개체들이 실험 동물이 되며, 6시간 후에 수명을 측정합니다. TEL 플레이트에 알이 있는지 확인합니다.

아직 알의 수가 충분하지 않다면, TEL 플레이트를 25 °C에서 최대 24시간까지 유지하십시오. 주기적으로 알이 생성되었는지 확인하십시오. 충분한 수의 알이 낳아지면, TEL 플레이트에서 성충을 제거하십시오.

전형적인 수명 실험에는 실험군당 30~90개의 알이 필요하지만, 단일 TEL 플레이트에서 수백 개의 알을 생성할 수 있습니다. 10~15마리의 생식 능력이 있는 성체는 6~8시간 동안 약 150개의 알을 낳습니다. 실험군을 비교할 때, 수명 차이가 큰 경우에는 30마리 정도의 적은 개체수로도 통계적 유의성을 확보할 수 있습니다.

더욱 미세한 차이를 구별하기 위해서는 더 많은 수의 동물을 사용해야 합니다. 이제 성체가 없는 TEL 플레이트를 20 °C에서 보관하여, 부화한 알과 벌레들이 L4 유충 단계까지 발달하도록 합니다. 야생형 C elegance의 경우 일반적으로 2일이 소요되지만, 발달 속도가 느린 표현형을 가진 균주의 경우에는 더 오래 걸릴 수 있습니다.

이 섹션에서는 연령이 동기화된 개체군의 생애를 추적하는 방법을 설명합니다. 먼저, L4 유충을 TEL 플레이트에서 준비된 AMP FUDR 플레이트로 옮깁니다. 테스트하려는 각 균주 또는 조건에 대해, 일반적으로 플레이트당 25~30마리의 벌레를 포함하는 플레이트를 2~3개 준비합니다.

AMP FUDR 플레이트를 20 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 벌레, 배지 및 박테리아 상태를 육안으로 평가하고 벌레를 새로운 AMP FUDR 플레이트로 옮겨줍니다. 벌레가 박테리아 먹이를 대부분 섭취했다면, 이는 보통 일주일에 한두 번 정도 발생합니다.

실험 초기 단계에서 상당수의 유충이 관찰된다면, 이는 일반적으로 벌레를 L4 단계가 아닌 성체 초기(young adults) 단계에서 AMP FUDR 플레이트로 옮겼음을 나타냅니다. 성체 초기 벌레는 FUDR이 효과를 나타내기 전에 알을 낳을 수 있으며, 때로는 유충이 FUDR의 영향을 벗어나 성체로 성장하기도 합니다. 이러한 유충들은 실험 결과에 혼선을 줄 수 있으므로, 이 경우 성체 벌레를 새로운 플레이트로 옮기고 유충이 포함된 기존 플레이트는 폐기하십시오.

살아있는 박테리아의 성장이 관찰되는 경우에도 벌레를 새로운 플레이트로 옮겨야 합니다. 일반적으로 AMP와 UV 살균을 병행하면 살아있는 박테리아가 실험을 오염시키지 않도록 보장할 수 있으나, 때때로 오염이 발생할 수 있습니다. 또한, 벌레를 옮겨 줍니다.

배지에서 곰팡이 성장이 관찰되는 경우, 조기에 발견했다면 피펫 팁이나 스패튤라를 사용하여 곰팡이 부분을 제거할 수 있습니다. 곰팡이의 직경이 몇 mm 이상으로 커지면, 일반적으로 벌레들을 새 플레이트로 옮기는 것이 더 효율적입니다.

2~3일마다 모든 벌레의 수명을 측정합니다. 해부 현미경을 사용하여 각 벌레의 생존 여부를 판별합니다.

플레이트를 가볍게 두드립니다. 두드리는 자극에 반응하여 움직이면 벌레가 살아 있는 것입니다. 플레이트를 두드려도 반응이 없는 경우, 머리 부분을 확대하고 백금성 전이 픽(platinum transfer pick)으로 벌레의 머리를 가볍게 두드립니다.

해당 벌레를 죽은 것으로 판정합니다. 머리를 움직여 반응하지 않으면, 죽은 벌레를 플레이트에서 제거하십시오. 모든 벌레를 확인한 후, 날짜와 살아있는 벌레 및 죽은 벌레의 수를 기록하십시오.

고체 배지에서 사육 중인 벌레는 때때로 굴을 파거나 벽면을 기어올라 플레이트 표면을 탈출할 수 있습니다. 탈출한 벌레는 연구 대상에서 완전히 제외합니다. 작업이 끝나면 플레이트를 20 degrees Celsius 배양기로 돌려놓으십시오.

2~3일 더 기다린 후 플레이트를 다시 확인합니다. 모든 벌레가 죽을 때까지 이 과정을 반복합니다. 매일 죽은 벌레의 수를 일반적으로 역산하여 매일 생존한 벌레의 비율을 계산하며, 이 데이터를 시간별 산란일을 기준으로 생존 곡선으로 도식화합니다.

0일 차. 20 °C의 UV kill bacteria 배지에서 배양된 야생형 C. elegans 균주의 일반적인 중앙값 수명은 알 단계부터 측정했을 때 약 25일입니다.

지금까지 수명을 측정하고 노화의 징후를 관찰하는 방법을 살펴보았습니다. 이 기본적인 절차를 수정하여 지원 텍스트에서 다루는 식이 제한 및 RNA 간섭을 포함한 다양한 환경 조건을 테스트할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.