전체 몽키 브레인에서 대규모 단백질 탐지에 대한 배치 Immunostaining

본 절차는 주변 매트릭스에 포함된 정렬 랜드마크를 사용하여 매립하기 위해 Neuroscience associates로 전달된, 4%PFA로 관류 및 적출되어 동결 보호 처리된 뇌를 수령함으로써 시작됩니다. 특수 바스켓과 용기를 사용하여 뇌를 관상면(coronal plane)으로 절단함으로써 원하는 두께의 연속 절편을 제작할 수 있으며, 이는 뇌의 전후 범위 전체를 나타내게 됩니다. 단백질의 뇌 전체 공간적 발현 패턴을 결정하기 위해 일괄 면역 처리(batch immuno processing)를 수행할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구소의 Shaheen Zur 박사입니다. 안녕하세요, 저 또한 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구소의 Mark Burke 박사입니다. 안녕하세요, 저는 몬트리올 대학교 검안대학 시각 신경과학 연구소의 소장인 Mo Petto 박사입니다.

오늘은 원숭이 뇌 전체에서 대규모 단백질 검출을 위한 일괄 면역 염색 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 사용하여 뇌 전체에 걸친 표적 단백질의 발현 패턴을 연구하고, 동일한 뇌 내에서 해당 단백질들의 발현을 비교 및 대조합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

조직학적 처리 이전에, 전신 관류 및 사후 고정을 거치고 단계별 sucrose 용액으로 동결 보호 처리된 영장류 뇌를 준비합니다. 이 단계에서 뇌는 임베딩 및 자체 기술을 이용한 프리섹셔닝(free sectioning)을 위해 neuroscience associates로 보내집니다. 샘플을 돌려받으면, 조직학적 처리가 완료된 후 절편들을 적절하게 정렬하고 재배치할 수 있도록 임베딩 매트릭스에 7개의 정렬 랜드마크가 배치되어 있음을 확인할 수 있습니다.

절단 과정 중에 디지털 이미지를 촬영하며, 이는 나중에 해부학적 지도의 3D 재구성에 사용될 수 있습니다. 신경과학 연구원이 조직을 처리하여 뇌 전체에 걸쳐 50 µm 두께의 연속적인 free floating 관상면 절편을 제작합니다. 이 과정이 완료되면, 절편의 조직학적 처리를 시작할 수 있습니다.

조직학적 처리 과정을 시작할 때, 일반적으로 항체 또는 염색당 약 140개의 절편을 처리하게 됩니다. 여기서는 비인산화 뉴로필라멘트 단백질에 대한 단클론 항체인 SMI 32 항체로 처리한 더 적은 수의 절편 샘플을 사용하여 기술을 시연하겠습니다. 전체 과정 동안 특수 염색 접시와 바스켓을 사용하여, 많은 수의 유리 부유 절편을 동시에 효율적으로 처리할 수 있습니다.

이렇게 하면 모든 절편에서 염색 결과가 일정하게 나타납니다. 첫 번째 단계는 TRITTON X 100과 정상 말 혈청(normal horse serum)이 포함된 PBS 기반 용액에서 절편을 60분 동안 배양하는 것입니다. 이는 배경 염색을 유발하는 항체 분자의 비특이적 결합을 감소시킵니다.

다음으로, 절편을 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, Triton X 100과 정상 말 혈청이 첨가된 PBS 기반의 SMI 32 항체 용액에서 절편을 세척액으로 10분씩 3회 세척한 후, Triton X 100과 정상 말 혈청이 포함된 PBS 기반의 비오틴화 Muse 2차 항체 용액에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다.

10분간의 세척 과정을 세 차례 더 반복한 후, 절편을 실온에서 1시간 동안 avadon biotin conjugated horse radish peroxidase complex 용액에 담가 둡니다. 마지막으로, 다시 한번 세척 과정을 거친 후 절편을 D amino benzine 반응액에 10분 동안 넣어 면역 반응성 뉴런 내에 갈색 염색이 나타나도록 합니다. 그 후 염색 바스켓을 꺼내 절편을 PBS에 담가 반응을 중단시킵니다.

PBS로 5분씩 2~3회 세척한 후, 대형 페트리 접시와 매우 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 절편을 유리 슬라이드에 개별적으로 부착하는 과정을 시작합니다. PBS 완충액 용기에서 절편을 들어 올려 젤라틴 코팅된 유리 슬라이드에 개별적으로 부착합니다. 그 다음 샘플을 흄 후드 내에서 하룻밤 동안 자연 건조시킨 후 다음 날 사용합니다.

마운팅 과정에서 남아 있을 수 있는 염 결정들을 씻어내기 위해, 섹션들을 탈이온수에 담가 헹굽니다. 그 후 슬라이드를 단계별 농도의 에탄올로 탈수시키고 자일렌으로 세척한 다음, per mount 마운팅 매질을 사용하여 커버글라스를 덮습니다. 이 단계에서 슬라이드는 마운팅 매질이 굳을 수 있도록 수평 상태로 약 1주일에서 10일 동안 보관해야 합니다.

이후 슬라이드는 슬라이드 박스에 보관하거나 현미경을 통해 이미징을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 원숭이 뇌 전체에 걸쳐 관심 대상인 표적 단백질의 완전한 발현 프로파일을 생성합니다. 여기서는 FMRP, neuN 및 SMI 32 발현의 스냅샷을 제공하는 대표적인 관상면 절편들을 보여줍니다.

동일한 원숭이 뇌의 사례입니다. 지금까지 전체 뇌에 걸쳐 관심 대상 단백질에 대한 일괄 면역 염색을 완료하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 절편이 다양한 용액 내에서 배양되는 동안 약하게 흔들어 주어야 하며, 항상 완전히 잠겨 있는 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

또한, 해부된 조직을 슬라이드 글라스에 마운팅할 때 충분한 시간을 갖고, 조직의 무결성을 손상시키지 않는 범위 내에서 주름과 접힌 부분을 최대한 제거하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.