의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

이 절차는 신선한 포도 주스 플레이트에서 30~60분 동안 배아를 수집하는 것으로 시작합니다. 플레이트를 호수 케이지에서 꺼낸 후, 젖은 브러시로 배아를 집어 양면 테이프 위에 올립니다. 핀셋의 한쪽 끝을 사용하여 배아 하나를 테이프 위에서 살며시 굴려 난막(corion)이 터질 때까지 조작합니다.

배아를 집어 올려 커버 위에 조심스럽게 놓습니다. 그 위에 het glue 층을 씌웁니다. 충분한 수의 배아가 확보될 때까지 이 과정을 반복합니다.

탈수 과정이 끝나면 배아를 주입할 준비가 된 것입니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 분자 및 세포 생물학과 Jonathan Sculley 박사 연구실의 Ingrid Bruce Musher입니다. 오늘은 초파리(drosophila)의 합포체 배아에 미세 주입하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 절차는有丝分裂(mitosis)에서 미세소관과 마이오신 기반 모터의 역할을 연구하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 특정 분열 단백질의 항체 또는 기타 억제제를 미세 주입합니다. 억제제가 유丝分裂에 미치는 영향을 분석함으로써 표적 단백질의 기능을 결정할 수 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 실험 시작 2~3일 전 준비 단계로, 플라스틱 병의 양측면에 약 1cm² 크기의 작은 구멍 두 개를 뚫어 산란 케이지를 제작합니다. 공기가 통할 수 있도록 구멍을 솜으로 채웁니다.

파리를 병 속으로 톡톡 두드려 넣은 다음 포도 주스 플레이트로 덮어줍니다. 효모가 포함된 상태에서 각 다리 케이지를 실온에 보관하면, 실험 시작 최소 하루 전부터 최대 10일 동안 파리가 알을 낳게 됩니다. 주사용 바늘을 준비하여 4 °C에서 보관하십시오.

실험 당일에 니들을 준비하고 로딩합니다. 먼저, 라벨링된 tubulin을 냉동고에서 꺼내 5분에서 15분 동안 얼음 위에 둡니다. 그다음, GPEM 버퍼로 희석한 후 4 °C에서 13,000 RPM으로 10분에서 15분 동안 원심분리합니다.

마지막으로, 1~2 µL를 바늘에 로딩하고 4 °C로 유지하십시오. 이는 바늘 내에서 온도 유도 중합이 일어나는 것을 방지하기 위함입니다. 커버슬립을 설정하기 전에, 양면테이프를 말아서 100 mL 병에 넣어 헵탄 접착제를 만드십시오.

헵탄 약 50 milliliters를 넣고 병을 밀봉한 후 며칠 동안 흔들어 줍니다. 배아를 준비하기 전에, 주입 전 배아를 놓아둘 탈수 챔버를 만듭니다. 이를 위해 35 millimeter 디쉬 하나를 100 millimeter 페트리 접시 안에 넣어 테이블을 만들고, 그 주변에 무수 황산칼슘 제습제를 채웁니다. 이때 제습제의 높이가 테이블보다 높지 않게 조절한 뒤 덮개를 덮습니다.

배아 준비를 시작하려면, 먼저 매시간 효모가 포함된 포도당 플레이트로 교체하여 호수 케이지에서 배아를 수집하십시오. 수집 시작 후 약 2시간 뒤에 배아의 이미지를 촬영해야 합니다. 커버 슬립을 준비하려면, 현미경 슬라이드 한쪽에 커버 슬립을 놓고 네 모서리를 테이프로 고정하여 움직이지 않게 합니다. 면봉을 사용하여 커버 슬립 위에 헵탄 접착제를 한 층으로 선을 그리듯 도포하십시오.

접착제는 점도가 낮아야 하며 수초 내에 건조되어야 합니다. 만약 너무 걸쭉하다면, 헵탄을 더 추가하십시오. 마지막으로, 커버 옆 슬라이드 위에 양면테이프 조각을 붙입니다.

적신 브러시로 슬라이드를 코팅합니다. 포도 주스 플레이트에서 배아를 조심스럽게 집어 슬라이드의 양면테이프 위에 올립니다. 그다음, 핀셋의 한쪽 끝을 사용하여 배아를 양면테이프 위에서 굴려 외막(corion)이 터질 때까지 조작합니다.

배아가 핀셋에 달라붙도록 코리안(Corian) 위에서 살살 굴려 집어 올린 후, 커버슬립 위의 헵탄 접착제 위에 놓습니다. 배아의 긴 쪽이 커버슬립의 긴 쪽과 평행하도록 미끄러뜨려 배치합니다. 한 줄에 10~20개의 배아를 배치합니다.

커버 슬립을 제거하고 3~8분 동안 탈수 챔버에 둡니다. 시간은 지역 습도와 주입량에 따라 달라집니다. 다음으로, 진공 그리스가 도포된 금속 챔버 위에 커버 슬립을 놓습니다.

마지막으로, 추가적인 탈수를 방지하기 위해 배아를 할로 카본 오일(halo carbon oil)로 덮어줍니다. 이제 배아에 주입할 준비가 되었습니다. 먼저, 16 x 대물렌즈 아래에서 배아를 찾으십시오.

배아를 다른 곳으로 옮기고 초점 평면을 유지한 상태에서 니들을 찾으십시오. 니들을 중앙에 맞춘 후 X 또는 Y 방향으로 움직이지 않게 위로 이동시키십시오. 니들을 열려면 커버슬립의 가장자리를 시야에 넣되, 니들이 위치할 곳은 피하십시오.

그리고 바늘을 동일한 초점 평면으로 내립니다. 커버 슬립이 바늘에 닿아 조심스럽게 깨질 때까지 매우 신중하게 이동시킵니다. 바늘을 위로 올립니다.

이제 배아가 시야에 들어오게 합니다. 바늘을 오일 속으로 내리고, 바늘에서 액체 방울이 적절하게 형성되는지 확인하십시오. 배아를 바늘 쪽으로 천천히 이동시켜 방울을 주입한 후, 배아를 멀리 이동시킵니다.

모든 배아에 주입이 완료되면, 60배 또는 100배 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 관찰할 준비가 된 것입니다. 대조군 배아는 이 영상에 보이는 것과 같은 모습이어야 합니다. 이것은 스피닝 디스크 공초점 현미경의 100배 대물렌즈로 촬영한, GFP tubulin과 RFP histone이 발현된 배아의 모습입니다.

표시된 총 시간은 8분입니다. 극과 극 사이 거리의 그래프는 재현성이 매우 높으며, 대조군 배아의 성공 여부를 판단하는 신뢰할 수 있는 척도가 됩니다. 그래프는 여기에 표시된 cycle 11에서 13까지의 모습과 같아야 합니다.

이 영상에서는 또 다른 대조군 배아가 제시되어 있습니다. 이 배아는 KLP 61 FGFP를 발현하며 r Domine tubulin이 주입되었습니다. 이 영상 역시 회전 원판 공초점 현미경의 100 x 대물렌즈로 촬영되었으며, 총 촬영 시간은 7분입니다.

이 영상은 미세주입 직후에 촬영되었으며, 영상 시작 부분에서 r Domine tubulin의 농도 구배가 명확하게 보입니다. 이 배아들은 Klp 61 F 항체를 미세주입한 후 Klp 61 F의 억제 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 방추사에서 Klp 61 FGFP가 소실되는 것을 확인할 수 있습니다.

지금까지 초파리 절개 배아의 미세 주입 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 반드시 대조군 실험을 실시해야 함을 기억하십시오. 먼저 완충액이나 루틴(rutin)만을 주입하는 연습을 하고, 세포 분열이 정상적으로 진행되는지 확인하십시오. 모든 주입 과정이 안정적이고 조직 손상을 일으키지 않는다는 것이 확인되면, 저해제를 주입하여 해당 저해 작용의 효과를 연구할 수 있습니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.