에 잔 심장을 떠올리 Drosophila

여기서는 성체 심장 해부를 위해 Drosophila의 박동하는 심장을 시각화하는 두 가지 기술을 제시하겠습니다. 먼저, 표시된 선을 따라 한 번의 절개로 머리와 흉부를 제거합니다. 다음으로, 생식기를 제거하고 핀셋을 사용하여 복부 체강을 개방하며, 장과 암컷 초파리의 경우 난소를 제거합니다.

유충 심장의 고정을 위해, 복부 제3 및 제4 마디의 복부 지방체를 조심스럽게 흡입하여 성체 심장을 노출시킵니다. 완충 용액에 놓인 단일 유충의 머리 영역 주변에 먼저 histo acral glue를 도포하여 고정합니다. 유충을 부드럽게 늘린 후, 후단과 유충 체벽의 측면에 접착제를 추가로 도포합니다.

안녕하세요, GI Fler입니다. 안녕하세요, Karen er입니다. 저희는 둘 다 Burnham 의학 연구소의 발달 및 노화 프로그램의 구성원입니다.

오늘은 Laval 유충 및 성체 초파리의 박동하는 심장을 시각화하기 위해 저희가 개발한 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 두 가지 준비 과정을 통해 초파리의 심박수 파라미터를 시각화, 조사 및 정량화합니다. 시작하기에 앞서, 먼저 인공 혈림프 용액을 준비합니다.

이 용액은 sucrose entry, helo를 포함하고 있으며, 사용 직전에 냉장 보관된 스톡 용액으로부터 인공 혈림프에 첨가해야 합니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해 인공 혈림프를 상온으로 맞추고, 최소 15분 동안 공기 버블링을 통해 용액에 산소를 공급하십시오. 다음으로, 표준 피펫 풀러를 사용하여 미세 모세관 여러 개를 제작하며, 이는 초파리의 지방체 제거에 사용됩니다.

모든 준비가 완료되면 성체 초파리를 마취시켜야 합니다. 이는 fly nap에 2~5분 동안 짧게 노출시켜 수행할 수 있으나, 초파리를 fly nap에 5분 이상 방치하지 않도록 주의하십시오. 초파리를 마취시키기 위해 단기간의 냉각 노출을 사용할 수도 있지만, 이산화탄소는 심박수와 활동성에 더 오래 지속되는 영향을 미치므로 권장되지 않습니다.

다음으로, 마취된 초파리를 석유 젤리가 얇게 도포된 페트리 접시에 등 면이 아래로 향하도록 놓습니다. 날개와 몸통의 소수성 큐티클이 젤리에 가역적으로 부착되지만, 필요한 경우 초파리의 위치를 다시 조정할 수 있습니다. 곡선형 스프링 가위를 사용하여 1차 절개를 수행합니다.

가위 날을 초파리의 다리 아래에 두고 목 근처의 등쪽 표면을 향해 아래로 각도를 조절하여 배치함으로써 이 작업을 수행합니다. 한 번의 절단으로 머리, 복측 신경삭 및 다리를 제거합니다. 그 후 스프링 가위를 사용하여 준비된 시료를 산소가 공급된 인공 혈림프 용액에 담급니다.

복부 제7절과 제8절로 구성된 복부의 후단부를 한 번의 절단으로 제거합니다. 이는 복부의 양쪽 가장자리를 따라 측면 절개를 하기 위한 통로를 확보하고, 후장과 복부 큐티클 사이의 연결을 끊는 역할을 합니다. 가위 날을 복부 끝단의 작은 개구부에 삽입하여 큐티클을 측면으로 절단합니다.

이렇게 하면 복부 큐티클의 한쪽 가장자리가 분리됩니다. 핀셋으로 덮개 부분을 잡고 복부의 반대편 측면 가장자리를 따라 비슷하게 절개합니다. 이제 분리된 복부 큐티클 덮개를 제거할 수 있습니다.

장과 기타 복부 기관은 보통 정밀 핀셋을 사용하여 조심스럽게 당겨 하나의 덩어리로 제거할 수 있습니다. 내부 기관을 제거하면 박동하는 심장관이 나타나는데, 이는 작은 동맥근에 의해 배측 큐티클에 여전히 부착되어 있으며 지방체로 둘러싸여 있습니다. 당겨진 모세혈관은 진공원에 연결된 1/16인치 플라스틱 튜브에 삽입됩니다.

흡입력은 팁의 직경에 비례하므로, 일단 설정이 완료되면 직경이 40 microns보다 큰 팁을 사용하는 피펫은 사용하지 말아야 합니다. 이 흡입 시스템은 심장관 주변의 과잉 지방을 제거하는 데 사용됩니다. 또한 큐티클 주변에 쌓인 기포나 이물질을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

심장 자체를 건드리지 않도록 극도로 주의해야 하며, 심장의 후방 부위는 매우 취약하므로 해당 부위 또한 피해야 합니다. 이제 성체 초파리의 심장관이 노출되었으며, 필요한 경우 심장이 뛰고 있어야 합니다. 큐티클과 이에 부착된 심장은 큐티클을 바세린에서 조심스럽게 들어 올린 후 다시 주의 깊게 눌러 배치함으로써 위치를 조정할 수 있습니다.

심장 조직에 닿지 않도록 주의합니다. 이 단계에서 표본을 담고 있는 용액을 신선한 인공 혈림프로 교체해야 합니다. 모든 조작을 시작하기 전, 이 표본을 산소 공급과 함께 20분에서 30분 동안 평형 상태로 두어야 합니다.

준비물을 60분 이상 유지해야 하는 경우, 신선한 인공 혈림프액으로 재관류해야 합니다. 이제 이 준비물은 광학 기록에 사용할 수 있으며, 전기생리학적 기록이나 조직학적 조작에도 사용할 수 있습니다. 유충 내부의 심장 박동을 시각화하려면 다른 기술이 필요합니다.

먼저, 실험 전날에 커버슬립을 준비합니다. 이쑤시개를 사용하여 약 50 to 70 µL의 Sylgard 용액을 22 by 22 mm 커버슬립 위에 옮겨 적습니다. Sylgard가 65 °C에서 밤새 경화되도록 둡니다.

다음으로, Brody 및 Bates 완충액을 제조하십시오. 제조된 완충액은 소분하여 -20 °C에서 보관하고 필요할 때 해동하여 사용할 수 있습니다. 마지막으로, histo acral 접착제를 도포하는 데 필요한 도구들을 준비하십시오. 먼저, 여러 개의 미세 모세관을 뽑아내십시오.

다음으로, 지름이 약 1/32인치인 작은 플라스틱 튜브를 1.5밀리리터 피펫 팁에 연결합니다. 튜브의 작은 쪽 끝에 모세관을 삽입하여, 모세관의 넓은 개구부가 반대쪽 끝을 향하게 합니다. 설정이 완료되면, 모세관을 접착제 한 방울에 담근 후 플라스틱 팁으로 부드럽게 흡입하여 모세관에 histo glue를 채웁니다.

접착제를 사용할 때는 접착제 모세관 끝에서 과도한 접착제를 제거할 수 있도록 두 번째 유리 모세관을 준비해야 합니다. 접착제는 완충 식염수와 접촉하기 전까지는 액체 상태이며, 접촉 후 몇 초 이내에 경화됩니다. 하지만 일반적으로 접착제 모세관 끝에서 제거하거나 표본에 도포하는 동안에는 충분히 가소성을 유지합니다.

이제 유충 고정을 시작하기 위해, Sylgard 커버슬립의 각 모서리 근처에 histo acral glue를 한 방울씩 떨어뜨립니다. 접착제 방울에 B&B buffer 50 µL를 추가하면 즉시 경화됩니다. 접착된 지점 사이의 공간을 B&B buffer로 채웁니다. 이렇게 하면 접착제가 슬라이드 위에 버퍼를 고정시켜 줍니다.

방황 단계의 L3 유충을 취해 얼음 위에 놓인 젖은 티슈 페이퍼 위에 2분 동안 둡니다. 이렇게 하면 유충의 움직임이 느려집니다. 다음으로 유충을 버퍼로 옮기고 등 쪽이 위로 향하도록 방향을 잡습니다.

이곳은 동일한 띠가 없는 유충의 측면입니다. 머리 부분과 실 가드(sill guard) 사이에 접착제를 빠르게 도포하십시오. 접착제는 매우 빠르게 경화되어 유충의 머리가 움직이는 것을 방지합니다.

포셉을 사용하여 동물의 후측 끝부분을 조심스럽게 잡고 부드럽게 늘려줍니다. 유충의 후반부 양측에 접착제를 도포하여 이 자세로 고정합니다. 체벽 근육에 의한 큐티클의 추가적인 움직임을 줄이기 위해 동물의 측면에 접착제를 더 추가합니다.

이제 유충이 이 위치에 고정되었습니다. 커버슬립을 인공 혈림프 또는 PBS가 채워진 작은 페트리 접시에 넣으면 체벽의 움직임으로 인한 간섭 없이 심박동을 기록할 수 있습니다. 반쯤 온전한 상태의 성체 초파리 심장은 해부 후 산소가 공급된 신선한 인공 혈림프 내에서 유지될 때 수 시간 동안 리듬감 있게 박동합니다.

대표적인 예시가 여기에 그리고 보충 영상 1에 제시되어 있으며, 3일령 유충의 심장이 여기에 나타나 있습니다. 우화 후 1~3주 된 어린 파리들은 일반적으로 1~3 Hz 사이의 규칙적인 심박수를 보입니다. 3주 이상 된 파리들은 일반적으로 더 부정형한 리듬을 보입니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 심장들은 산소화된 인공 혈림프 내에서 수 시간 동안 자발적으로 박동할 수 있습니다. 해부 과정으로 인해 손상된 성체 파리의 심장은 일반적으로 이완되지 못하고 종종 통제 불능으로 박동하는 극심한 수축 국소 부위를 보입니다. 3주 미만의 파리에서는 1 Hz보다 느린 심박수가 거의 관찰되지 않습니다.

결과적으로, 이러한 표본은 손상된 것으로 간주되어 폐기됩니다. 지금까지 광학 이미징을 위한 유충 및 성체 초파리 심장의 준비 방법을 시연하였습니다. 반절개 표본을 제작할 때 심장 자체를 절대 건드리지 않도록 주의하십시오.

여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.