동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서

ISTH라고 알려진 기술로 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 테트라 염색(tetra staining)을 결합함으로써, 바이러스 항원 특이적 면역 작동 세포와 바이러스에 감염된 세포 및 조직 간의 상대적 수와 공간적 관계를 결정할 수 있습니다. ISTH는 신선한 SIV 감염 조직을 agros에 매몰하는 것으로 시작합니다. 조직은 vibrato를 사용하여 200 micron 두께의 절편으로 절단하며, 바이러스 항원에 대해 염색합니다.

FITC 표지 MHC 테트라머를 사용하여 특정 CD8 양성 세포를 염색합니다. 동결 후, 이 염색 섹션들을 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 8 µm 두께의 섹션으로 추가 절단하고, 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하여 바이러스에 감염된 세포의 위치를 확인합니다. 공초점 현미경을 사용하여 이중 염색 섹션의 이미지를 획득하고, 최종적으로 원래의 두꺼운 섹션을 재구성함으로써 면역 작동 세포와 표적 세포 간의 관계를 밝힙니다.

SIV 초기 감염을 조사하기 위해 이 절차를 사용하는 것은 이후 발생하는 질병의 중증도를 예측하는 좋은 방법임이 입증되었습니다. 안녕하세요, 미네소타 대학교 미생물학과의 Ashley HA 교수 연구실 소속 Chinen Lee입니다. 안녕하세요, 미네소타 대학교 수의 생명과학과의 조교수 Pam Skinner입니다.

오늘은 인시튜 테트라머 염색과 인시튜 하이브리다이제이션을 결합한 ISTH 과정에 대해 보여드리겠습니다. 오늘 시연하는 인시튜 테트라머 염색과 인시튜 하이브리다이제이션의 조합 외에도, 저희는 항원 특이적 CD8 T 세포의 위치, 풍부도 및 단백질 발현 프로파일을 인시튜에서 결정하기 위해 인시튜 테트라머 염색과 면역조직화학 염색을 결합하여 일상적으로 사용하고 있습니다. 오늘 두꺼운 절편을 이용한 인시튜 테트라머 염색을 도와주실 분들은 Heon Kim 박사와 Terry Matala이며, 얇은 절편 준비와 인시튜 하이브리다이제이션을 도와주실 분은 So입니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, 멸균된 PBSH가 담긴 Vibram bath를 2°C까지 냉각하십시오. 진동 블레이드 각도를 27도로 설정하십시오. 가능한 경우, 신선한 조직은 얼음 위에서 냉각 상태로 유지하고 조직 수확 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.

냉각으로 인한 분해를 최소화하기 위해, 진동기(vibram)를 사용하여 신선한 조직을 절단하고, 결합 조직을 다듬어낸 뒤 메스로 검체를 작은 조각으로 자릅니다. 이 조각들을 웨이 보트(whey boat)에 넣고, 약 40°C에서 녹인 PBS 내 4% low melt agarose로 덮습니다. 조직이 디시 바닥에 접촉해 있는지 확인하고, 조직 조각이 떠 있다면 아래로 눌러준 뒤 얼음 위에서 3~5분간 응고시킵니다.

여기서는 비장 조직을 사용하고 있지만, 메스를 사용하여 림프절, 질, 자궁경부, 자궁 또는 다른 신선한 조직을 사용할 수도 있습니다. 조직 주변의 아가로스(agros)를 절단하고, 핀셋을 사용하여 아가로스에 매립된 조직을 조직 블록으로 조심스럽게 옮깁니다. 이어서 Vibram 조직 블록에 Loctite 접착제를 도포합니다.

조직 조각을 조직 블록에 고정시킨 후에는 움직이지 마십시오. 얼음 위에서 약 10분 동안 건조시킵니다. 다음으로, 조직 블록을 진동 절편기(vibrator)에 장착하고 매우 느린 전진 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 조직을 200 µm 두께의 절편으로 자릅니다.

붓을 사용하여 절단된 조직 절편을 1 mL의 냉각된 PBSH가 미리 채워진 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 설치된 전용 조직 챔버로 옮깁니다. 각 조직 챔버에 최대 4개의 조직 절편을 넣습니다. 바이러스 특이적 T 세포를 염색하기 위해 샘플에 라벨을 붙이고 고무줄로 플레이트의 뚜껑을 고정합니다.

ZI 결합 테트라머를 먼저 블로킹 버퍼에 희석하여 0.5 micrograms per milliliter 농도로 만듭니다. 이 용액을 24웰 플레이트에 웰당 1 milliliter씩 피펫으로 분주합니다. 갓 절단한 조직을 플레이트의 조직 챔버로 옮긴 후 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 쉐이킹하며 반응시킵니다.

후속 단계에서 용액의 교차 오염을 방지하기 위해 서로 다른 샘플을 포함하는 조직 챔버 사이에 빈 웰을 하나 둡니다. 이 단계에서 세포 외 또는 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 항체를 추가할 수 있습니다. 세척을 위해, 1차 배양 후 사용할 차가운 PBSH가 담긴 24웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다.

조직 챔버를 미리 채워둔 플레이트로 옮겨 각 20분씩 두 번 세척하며, 옮기기 전에 조직 챔버에서 액체를 최대한 배출하십시오. 또한, 조직 챔버를 이동할 때 한 샘플의 내용물이 다른 샘플로 떨어지지 않도록 주의하고, 조직 챔버 내의 절편이 벽면에 달라붙지 않는지 확인하십시오. 고정 후에는 PBS에 희석된 신선한 4% paraldehyde를 사용하여 상온에서 2시간 동안 절편을 고정하십시오.

테트라머의 신호를 증폭시키기 위해 차가운 PBSH로 5분씩 두 번 세척합니다. 블로킹 버퍼 내에서 1:10,000의 비율로 rabbit anti fitzy 항체를 처리하여 절편을 1~3일 동안 배양합니다. 이 단계에서 세포 내 에피토프에 대한 항체를 추가할 수 있습니다.

항체를 첨가하기 전에 세포를 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단해야 합니다. 신호를 증폭하기 위한 두 번째 장시간 배양 후에 항원 회복 과정이 필요할 수도 있습니다. 각 세션마다 PBSH로 절편을 최소 20분에서 최대 수 시간 동안 3회 세척하십시오.

적절한 형광 표지 항체를 사용하여 최종 배양을 수행합니다. 예를 들어, rabbit anti fitzy 항체에 결합하여 테트라머 염색 세포가 적색 형광을 띠게 하려면 goat anti rabbit SI three를 사용할 수 있습니다. 킬러 T 세포를 시각화하기 위해 CD eight와 같은 관심 단백질을 대조 염색하는 데 마우스 항체를 사용했다면, goat anti-US Alexa 488를 사용하여 마우스 항체에 결합시킴으로써 항체 염색 세포가 녹색 형광을 띠게 할 수 있습니다. 각 항체의 희석 배수는 실험적으로 결정해야 합니다.

1~3일 동안 배양하며, 빛이 형광을 소멸시키므로 배양 중 및 그 이후에도 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 섹션이 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 마지막으로 섹션을 다시 고정하여 테트라머와 항체가 제자리에 고정되도록 합니다. 세척 후 4 mg/mL의 N-propyl gallate가 포함된 글리세롤 젤라틴을 사용하여 현미경 슬라이드에 마운팅하고, in-situ hybridization을 위한 박절 단면을 준비할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.

이제 공초점 현미경을 통해 in situ tetramer 염색 절편을 분석하여 항원 특이적 CD8+ T 세포의 국소적 분포, 풍부도 및 단백질 발현 패턴을 결정할 수 있습니다. 제시된 이미지에서는 SIV에 감염된 rhesus macaque의 비장 조직 절편을 gag tetramer로 염색하여 SIV 특이적 CD8+ T 세포를 표지하였으며, CD20 항체와 CD3 항체로 대조 염색하였습니다. 항체를 이용한 대조 염색 결과는 다음 단계에서 소실되므로, 다음 단계로 진행하기 전에 in situ tetramer 분석을 수행하는 것이 중요합니다.

슬라이드에서 두꺼운 절편을 떼어내기 위해 200 µm 두께의 절편을 히트 블록에서 70 °C로 5분 동안 가열하여 박절 절차를 시작합니다. 절편이 분리되면, 먼저 플라스틱 몰드 바닥에 OCT를 채운 후 드라이아이스 위에서 OCT에 절편을 포매합니다. 그다지 조직을 OCT 위에 놓고 다시 OCT로 덮어줍니다.

크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 OCT에 매립된 시료로부터 8 µm 두께의 절편을 제작하고, 이 8 µm 절편을 실로나이즈드 슬라이드(siloized slides)에 부착합니다. 이후 슬라이드는 밀폐 용기에 담아 -80 °C에서 보관하여 추후 in situ hybridization을 수행할 수 있습니다. S 35로 표지된 바이러스 특이적 리보 프로브(rib probes)를 이용한 표준 in situ hybridization법으로 바이러스 감염 세포를 검출합니다.

이 절차에는 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 코팅 및 슬라이드 마운팅 과정이 포함됩니다. 형광 호환 파라마운트 매질(paramount medium) 내에서, 에피 튜브 블루 반사 장치가 장착된 BioRad MRC 1000 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득합니다. 인시투 테트라 염색(insitu tetra staining)의 경우, 적색 테트라 형광색소에는 EPI one 605를, 인시투 하이브리다이제이션(insitu hybridization)의 녹색 CD8 형광색소에는 EPI 2 522 DF 32를 사용하여 시각화합니다.

현상된 방사선 사진에서 인시츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 신호로 인해 생성된 은 입자를 관찰하기 위해 EPI two blue reflection을 사용하십시오. 이미지 획득을 시작하려면, 각 섹션의 이미지를 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 순서대로 획득하고, 각 이미지가 인접한 이미지와 약 20% 중첩되도록 캡처하십시오. 재구성된 몽타주 이미지에 빈틈이 생기는 것을 방지하기 위해, Excel 파일에 각 이미지의 행과 열에 따라 이름을 지정하십시오.

슬라이드의 데이터 수집이 완료되면, 저자로부터 제공받은 Photoshop 7 액션 절차를 통해 공초점 어시스턴트 소프트웨어를 사용하여 각 채널의 Z-시리즈 이미지를 단일 이미지로 투영하고, 세 채널의 투영된 이미지를 하나의 RGB 이미지로 자동 병합하십시오. 그다음, 병합된 이미지들을 레이어별로 스티칭하여 전체 섹션의 몽타주 이미지를 생성하십시오. Metamorph 또는 Photoshop을 사용하여 몽타주 내의 개별 은 입자와 테트라머 염색물을 세포와 연관시키십시오.

바이러스 RNA 양성 및 테트라머 양성 세포의 중심점 XY 좌표 또는 OID를 할당합니다. OID 데이터를 각 세포에 대한 숫자 형태로 Excel 파일로 내보내고, Excel 파일에 수집된 데이터를 사용하여 섹션 내의 전체 테트라머 양성 및 바이러스 RNA 양성 세포 수로부터 면역 작동 세포(e 세포) 대 바이러스 표적(T 세포)의 비율을 결정하여 테트라머 양성 세포와 RNA 양성 세포 사이의 공간적 관계를 파악합니다. Excel 파일에서 각각의 플롯을 복사하여 Photoshop 문서에 붙여넣습니다.

레이어의 불투명도를 낮추어 격자를 정렬하고 크기를 조정하여 색상이 일치하도록 한 뒤, 선택하여 새 레이어에 복사하고 붙여넣습니다. 파란색 RNA 양성 세포의 위치를 확인한 후 격자 정렬에 사용한 레이어를 삭제하면, 평탄화된 이미지에서 테트라머 양성 세포와 바이러스 RNA 양성 세포의 위치가 나타납니다. 여기에 제시된 ISTH 방법을 사용하여, 질 내 접종을 통한 진입 경로 및 감염이 확산되는 림프 조직에서의 SIV 감염에 대한 면역 반응을 추적할 수 있습니다.

감염 후 10일째에 이 조직 부위에는 다수의 감염된 세포들이 존재하지만, 3일이 더 지난 시점에서도 녹색으로 염색된 CD A 양성 세포들은 관찰되는 반면, 적색으로 염색된 SIV 특이적 tetra 양성 세포들은 아직 나타나지 않았습니다. 따라서 면역 반응이 너무 늦어 감염을 제거하지 못하는 상태입니다.

하지만 감염 3주 후에는 특히 유입 경로에서 감염된 세포의 감소가 뚜렷하게 관찰됩니다. 우리는 ISTH를 사용하여 이러한 감소 정도가 테트라머 양성 면역 작동 세포의 공간적 근접성 및 상대적 수와 상관관계가 있음을 보여주었습니다. N-S-I-V-R-N-A 양성 표적 세포, 우리는 이를 생체 내 E 대 T 비율이라고 부릅니다.

이 방법을 통해 감염된 림프절 내의 이펙터 세포는 빨간색으로, 바이러스 표적 세포는 파란색으로 표시하여 공간적 관계를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 많은 이펙터 세포와 표적 세포가 서로 근접해 있으며, 일부 영역에서는 많은 이펙터 세포가 단일 S-I-V-R-N-A 양성 세포를 둘러싸고 있는 반면, 다른 영역에서는 S-I-V-R-N-A 양성 세포가 단독으로 존재합니다. 세포의 위치를 결정하고 Excel 파일에 각각의 수를 기록하면 E:T 비율을 간단히 계산할 수 있습니다.

바이러스 감염의 최적의 제어는 녹색 표적 대비 적색 작동 세포의 비율이 43:1로 크게 상회하는 것과 상관관계가 있습니다. 이 경우, 감염이 시작된 자궁경부와 질에서 E:T 비율은 림프절보다 낮았습니다. 높은 E:T 비율과 정점 대비 바이러스 수치 감소 사이의 양의 상관관계는 진입 지점에서의 더 강력한 면역 반응이 더 나은 감염 제어로 이어진다는 것을 나타냅니다.

지금까지 in situ에서 매우 특이적인 CDAT 세포와 바이러스 감염 세포를 동시에 검출하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술을 통해 조직 내에서 항원 특이적 T 세포와 바이러스 감염 세포를 동시에 시각화할 수 있습니다. 본 절차를 수행함으로써 이 기술은 CD8+ T 세포 기반 백신 평가 및 기타 비백신 병원체와 숙주의 상호작용 연구에 적용될 수 있습니다.

in situ 하이브리다이제이션을 수행하기 전, 모든 시약에 RNA가 포함되지 않도록 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.