조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

세포 캡슐화의 단계별 과정은 하이드로젤 몰드 및 기타 재료의 준비와 멸균으로 시작하며, 이어서 세포를 각 젤 세트용 튜브에 개별 집단으로 분리합니다. 그 다음 세포가 존재하는 상태에서 젤화가 수행되며, 이후 in vitro 또는 in vivo 배양 기간을 거칩니다. 세포 거동에 대한 하류 분석에는 생존율, 형태, 증식 및 분화 테스트가 포함될 수 있습니다.

안녕하세요, 펜실베이니아 대학교 바이오공학과 Jason Burdick 박사님 연구실의 Amidio Kahan입니다. 오늘은 조직 공학을 위한 3D 하이드로겔 내 세포 캡슐화 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 하이드로겔의 조성과 구조가 캡슐화된 세포의 거동에 미치는 영향을 연구합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, PBS에 광개시제 Irgacure 2959 또는 I2959를 0.5%weight 용액으로 준비하십시오. 이를 혼합한 후 37 °C의 암실에서 2~3일 동안 배양하십시오.

준비가 되면, 시린지 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 실온에서 보관하십시오. 다음으로, Microsoft Excel과 같은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 제시된 폴리머와 가교제의 필요량을 계산하십시오. 여기 아크릴레이트 반응기로 기능화된 히알루론산이 있습니다.

또한 아미노산 시스테인, 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산을 포함하는 기능성 접착 도메인의 펜탄트 펩타이드 양을 계산하십시오. 시스테인은 폴리머에 결합시키기 위한 것입니다. 필요한 양의 폴리머 가교제와 펜탄트 펩타이드가 결정되었으면, 각각을 칭량하여 에펜도르프 튜브에 넣으십시오.

계산 스프레드시트를 그에 맞게 조정하십시오. 실제로 얻은 폴리머 질량에 대해서는 겔 몰드 준비 단계로 진행하십시오. 면도날을 사용하여 개별 포장된 멸균 팁의 끝부분을 잘라내십시오.

1 mL 일회용 주사기. 젤에 포토 패턴을 적용하기 위한 몰드로 사용할 경우, 단면이 평평하게 절단되었는지 확인하십시오. 마지막으로, 캡을 열어둔 주사기 몰드 EOR 튜브와 기타 필요한 재료들을 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내부에 설치된 살균등 아래에 30분 동안 두어 멸균하십시오.

멸균이 완료되면, 실험 기구의 멸균 후 세포 준비 단계로 넘어갑니다. 후드 내에서 작업하며, 마이칼(mical) 유형 가교에 사용된 폴리머에는 멸균된 TEA를, 자유 라디칼 가교에 사용된 폴리머에는 멸균된 PBS를 첨가하십시오. 펜던트 잔기(pendant moiety) 튜브에 해당 버퍼를 넣고 볼텍싱합니다.

펜던트 부분을 고분자에 부착하기 위해, 펩타이드의 INE 그룹에 있는 티올을 통해 알킬화된 히알루론산에 펜던트 부분을 결합시키려면, 이를 고분자 용액에 첨가하고 파라필름으로 밀봉하십시오. 간단히, 볼텍싱 후 37 °C에서 혼합하며 배양합니다. 펜던트 부분이 부착되는 동안, 캡슐화할 세포인 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 PBS로 세척하여 준비하십시오.

그 후 실온에서 trypsin으로 1분 동안 배양하고, trypsin을 제거한 뒤 37°C에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 HMSC 성장 배지를 첨가하여 trypsin을 중화시키고 플레이트 표면에서 세포를 분리합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

계수한 세포를 각 겔 세트에 필요한 적절한 수의 분량으로 나누십시오. 10 million cells/mL 밀도로 50 µL 겔 3개를 한 세트로 구성하는 경우, 1.5 million cells를 개별 원뿔형 튜브에 나누어 담으십시오. 겔 형성 시간으로 인해 개별 세트당 4개 이상의 겔을 준비하지 마십시오.

다음으로 세포를 500 RCF에서 6분 동안 원심 분리합니다. 세포가 침전되는 동안 실온에서 mical edition 교차결합을 위한 중합 혼합물을 준비합니다. 교차결합제에 버퍼를 추가하여 적절한 농도를 맞춥니다.

광개시 자유 라디칼 가교를 위해, 미리 준비한 I 2 9 5 9 용액을 폴리머 용액에 첨가합니다. 최종 개시제 농도가 0.05%weight가 되도록 전체 겔 설정 부피의 10%를 첨가합니다. 이제 세포와 중합 혼합물이 하이드로겔 내 캡슐화 준비가 되었습니다.

먼저 원심분리된 세포에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1차 흡입 후 액체가 가라앉을 때까지 기다렸다가, 세포 펠렛을 손상시키지 않는 범위 내에서 배지를 최대한 다시 흡입하여 제거합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 폴리머 용액을 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다.

용액을 천천히 10회 정도 피펫팅하여 세포가 균일하게 분산되도록 합니다. 마이컬(mical) 타입 첨가 반응의 경우, 구경이 넓은 피펫 팁을 사용하여 고분자 세포에 적절한 부피의 가교제 용액을 첨가합니다. 혼합합니다. 피펫을 원하는 개별 겔 부피로 설정합니다.

용액을 피펫으로 상하 혼합하여 균질화한 후 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 세포가 고르게 분포되도록 이 단계를 신속하게 수행하고, 가교 결합을 위해 배양 후드에서 10~30분 동안 배양합니다. 광개시 자유 라디칼 가교 결합을 위해.

적절한 부피를 시린지 팁 몰드에 분주합니다. 라디칼 가교를 위해 시린지를 365 nanometer 파장의 UV 광선에 10분 동안 노출시킵니다. ACRL 기능화 폴리머의 경우 4 milliwatts per centimeter squared의 UV 광선이 일반적으로 사용됩니다.

UV 광 노출 전 세포가 가라앉는 것을 최소화하기 위해 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 가교 결합 후, 배양 및 분석을 위해 배지가 담긴 조직 배양 플레이트의 웰에 겔을 넣으십시오. 하이드로겔의 가교 결합은 순차적으로 진행할 수도 있습니다.

먼저, 작용기화된 염료인 metholated rumine을 겔 내 최종 농도가 20 nanomolar가 되도록 첨가합니다. 이 염료는 겔의 라디칼 가교 영역에 우선적으로 통합되므로 패턴 시각화에 도움을 줍니다. 그런 다음, 다음에 설명할 이론적 가교 수의 일부만 생성하는 mic 유형의 중합 반응을 시작합니다.

자유 라디칼 가교법을 위해서는 Adobe Photoshop 또는 Illustrator와 같은 프로그램으로 설계하여 투명 마스크에 직접 인쇄한 마스크가 필요합니다. 마스크의 크기는 원형 시린지 상단과 일치해야 합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 마스크를 겔 표면에 직접 부착하고, 빛에 노출시켜 겔을 가교합니다.

캡슐화 1시간 후 HA 기반 하이드로젤 내의 HMC가 여기에 추가로 제시되어 있습니다. 합성된 하이드로젤은 일반적으로 투명하기 때문에 광학 현미경을 사용하여 세포의 형태를 시각화할 수 있습니다. 동일한 세포의 생존능을 캡슐화 24시간 후에 형광 live dead 염색 키트를 사용하여 시각화하였습니다.

생존 세포를 검출하기 위해 calcium M을 사용하고 죽은 세포를 위해 atherium homodimer를 사용한 결과, 95% 이상의 생존율이 관찰되었습니다. 또한, 세포가 분석 시약을 대사하여 색이 변하는 정도를 통해 세포 증식 수준을 결정하는 alamar blue 분석을 수행하였습니다. 세포 염색은 분해성 및 접착성 HA 기반 하이드로겔 내로 캡슐화한 7일 후의 H HMCs를 대상으로 표준 고정 및 투과화 절차를 사용하여 진행되었습니다.

플루오레세인으로 표지된 phalloidin을 사용하여 세포 액틴을 시각화하고, dpi로 핵을 염색하였습니다. 하이드로젤 매트릭스 내의 국소 접착물을 시각화하기 위해 cullin에 대한 면역염색을 실시하였습니다. 라디칼 중합된 HMSC 캡슐화 HA 하이드로젤의 탈수, 파라핀 매립 및 절편 제작을 표준 프로토콜에 따라 수행한 후 조직학적 염색을 실시하였습니다.

배양 일주일 후, 핵을 표시하는 hematoxylin과 결합 조직을 표시하는 ASIN, 그리고 글리코사미노글리칸을 위한 청색 염색을 통해 염색하였습니다. 캡슐화된 줄기세포의 분화 정도를 정량화하기 위해 Realtime PCR을 사용합니다. 배경값을 뺀 후, 상시 활성화된 하우스키핑 유전자인 수동 참조 신호와 비교하여 임계 형광값에 도달한 사이클 수를 통해 표적 유전자의 발현 수준을 결정합니다. 지금까지 3D 하이드로젤에 세포를 캡슐화하고 젤 내에서의 세포 행동을 연구하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 사용할 때는 멸균 버퍼 용액과 시약을 장기 보관하거나 살균 UV 램프로 멸균하여 재료의 완전한 멸균 상태를 보장하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.