공학 세포 투과 단백질

지난 15년 동안 세포 기능의 조절은 DNA transfection 또는 viral transduction이라는 고전적인 접근 방식을 통해 이루어져 왔습니다. 이에 더해 또 다른 방법이 발전하였습니다. 단백질 transduction을 통해, 표적 단백질에 융합되어 세포 내 흡수를 촉진하는 작은 펩타이드를 이용하여 생물학적 활성 단백질을 포유류 세포로 직접 전달할 수 있습니다.

DNA를 사용하지 않으므로 외인성 유전자 삽입의 위험이 방지됩니다. 앞서 언급한 전통적인 방법들과 달리, 단백질 트랜스덕션은 단백질을 적정 가능한 방식으로 전달할 수 있게 합니다.

또한, 소규모 세포 집단뿐만 아니라 분열 후 뉴런(post mitotic neurons)과 같이 분열하지 않는 세포들도 조절할 수 있습니다. 재조합 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 Paciz 벡터 시스템의 사용을 권장합니다. 이는 N-말단 및 C-말단 변이체로 구성된 모듈형 벡터 시스템입니다.

두 벡터 모두 정제를 목적으로 표적 유전자를 쉽게 삽입할 수 있도록 설계되었습니다. 히스티딘 태그뿐만 아니라 단백질 투과 도메인도 통합되어 있습니다. 본 실험의 경우, 세포 내 분포를 위해 세포 흡수를 촉진하는 HI 바이러스 유래 도메인을 사용하였습니다.

제어 목적으로 핵 국소화 신호를 추가하여 벡터를 완성하며, 융합 태그는 간단히 제거할 수 있습니다. 또한, 이러한 태그의 배열은 융합 단백질의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 수율과 순도뿐만 아니라 세포 내 위치 및 생물학적 기능에 미치는 영향은 예측할 수 없습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Bernard Mus이며 독일 본에 위치한 재건 신경생물학 연구소의 줄기세포 공학 그룹에서 근무하고 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Christoph P이며 저 또한 Hoover Lab의 일원입니다. 저희 연구 그룹은 다양한 포유류 세포에 생물학적으로 활성된 단백질을 직접 전달하기 위해 단백질 도입 기술을 집중적으로 활용하고 있으며, 오늘은 e coli에서의 발현 및 정제 과정을 안내해 드리고자 합니다.

그 후, 전체적인 발현, 정제 및 응용 과정을 예시하기 위해 세포 배양에서 세포 영구 융합 단백질을 적용하는 방법을 보여드리고자 합니다. 저희는 마우스 배아 줄기세포를 유전적으로 변형하기 위해 부위 특이적 재조합 Cre를 이용합니다. 자, 이제 시작하겠습니다.

밤샘 배양액을 접종하기 위해, -80 °C의 글리세롤 스톡에 보관된 이미 형질전환된 박테리아를 사용합니다. 이 박테리아들은 이미 decre 재조합을 인코딩하는 벡터를 포함하고 있습니다. 피펫 팁을 사용하여 박테리아 소량을 긁어낸 후, 이를 밤샘 배양액이 담긴 비커에 떨어뜨립니다.

밤샘 배양액은 최종 농도 0.5%의 glucose와 ml당 50 micrograms의 carbonic insulin이 첨가된 LB 배지로 구성됩니다. 그 후 비커를 37 °C로 설정된 배양기에 넣어 부위 특이적 Recombinate Cree를 발현시킵니다. 대규모 발현 배양에는 미리 가온된 TB 배지를 사용합니다.

발현 속도를 높이기 위해, 재조합 단백질 발현 온도인 37 °C로 데운 TB 배지를 사용할 것을 권장합니다. 다음으로, 최종 농도가 0.5%가 되도록 TB 배지에 glucose를 첨가합니다. glucose는 유도 전 발현 배양액의 성장 과정 동안 융합 단백질의 기저 발현이 증가하는 것을 방지합니다. 마지막으로, decree 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 보유한 박테리아만 포함된 순수 배양을 보장하기 위해, 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 발현 배양액에 ampicillin을 첨가합니다.

이제 하룻밤 동안 배양한 배양액을 준비하여 1:50의 비율로 발현 배양액에 접종할 수 있습니다. 그 후 비커를 37°C로 설정된 배양기에 옮깁니다. 발현 과정 전반에 걸쳐 정기적으로 샘플을 채취하여 흡광도(optical density)를 측정해야 합니다.

배양액의 광학 밀도가 1.5에 도달하는 즉시, 0.5 millimolar의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 박테리아를 유도합니다. 1시간의 유도 후, 발현 배양액을 튜브에 옮기고 원심 분리를 통해 수확합니다. 이를 위해 SLA 3000 로터를 사용합니다.

원심분리기를 4 °C에서 5,000 rpm의 속도로 10분 동안 가동합니다. 그 후 상층액은 버리고 박테리아 펠렛은 -20 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 냉동된 펠렛은 발현 배양액 1 L에 해당하는 양의 lizza 버퍼에 다시 현탁합니다.

Lizza 버퍼 10 mL를 사용하고, 용액이 균질해질 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 그 후 현탁액 1 mL당 1 mg의 라이소자임을 추가합니다. 효소가 박테리아를 용해할 수 있도록 용액을 20분 동안 혼합합니다.

그 후, DNA를 절단하여 용액의 점도를 낮추기 위해 Benzonase를 1:1000 비율로 희석하여 추가로 15분 동안 처리합니다. 마지막으로, 세포 용해를 확실히 하기 위해 초음파 분쇄기(sonicator)를 사용합니다. 인증 완료 후, 45%의 출력으로 1분 30초 동안 프로그램을 가동합니다.

정제 과정의 모든 단계에서 조추출액(crude lysate)이나 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 채취하는 것을 잊지 마십시오. 글리세롤 스톡 내에서 단백질이 침전되는 경향이 있으므로, 현탁액 1 mL당 얼음처럼 차가운 TSB 버퍼 1 mL를 추가하는 것이 매우 중요합니다. 이 단계를 생략할 경우, 용액을 짧게 혼합하면 조추출액은 이제 원심분리할 준비가 됩니다.

이를 위해 SS 34 로터를 사용합니다. 원심분리기는 4 °C에서 17,000 RPM으로 30분 동안 작동시킵니다. 과정이 끝나면, 원심분리된 상층액을 조심스럽게 새 50 ml Falcon 튜브로 옮깁니다.

이제 상층액에 니켈 항-A 슬러리를 추가하십시오. 항-A는 히스티딘 태그 융합 단백질의 적절한 정제를 위한 핵심 시약입니다. 히스티딘은 니켈 이온과 복합체를 형성하여 친화성 정제를 가능하게 합니다. 이제 파킨 튜브를 40 °C에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 섞어주십시오.

1시간 후, 현탁액을 20 ML 컬럼에 도포하고 중력 흐름에 의해 용액이 통과하도록 합니다. 대규모 생산의 경우, 현탁액을 여러 컬럼으로 나누어 분할하는 것이 가능합니다. 그런 다음 15 millimolar의 innersole이 포함된 완충액으로 컬럼을 두 번 세척합니다.

사용되는 버퍼의 양은 레진 부피에 따라 달라집니다. 세척 목적으로는 nickel NTA 2 mL가 레진 1 mL에 해당합니다. 세척 후 컬럼에 세척 버퍼를 레진 부피의 5배만큼 넣으며, 이제 단백질을 용출할 준비가 되었습니다.

따라서 250 millimolar 농도의 immuno 용출 버퍼를 사용합니다. 이때 레진의 색상이 녹색으로 변하는 것을 확인하십시오. CRE 단백질의 고농도로 인해 OID 분획이 때때로 탁해질 수 있습니다.

이를 방지하기 위해 용액을 혼합하고 추가적인 lys 버퍼를 첨가하며, 모든 분획을 풀링한 후 용해 튜브로 옮깁니다. 용해 과정은 제거할 것입니다. 첫 번째 투석 단계는 고농도 염을 포함하는 버퍼를 대상으로 수행됩니다. 1시간 후, 고염 버퍼를 교체하고 하룻밤 동안 투석 과정을 적용합니다.

다음 날, 투석 튜브를 고농도 염 버퍼에서 꺼내 글리세롤 버퍼로 옮깁니다. 3~5시간 후, 글리세롤 버퍼를 교체하고 다시 하룻밤 동안 투석을 수행합니다. 글리세롤 버퍼를 이용한 용해를 통해 최소 3배 농축된 스톡 용액을 얻을 수 있습니다.

이제 스톡 솔루션을 -20°C에서 수년 동안 활성 저하 없이 보관할 수 있습니다. 품질 보증을 위해 수집한 SDS page 샘플을 겔에 로딩하고 이어서 염색할 수 있습니다. Coomassie 염색 시, Cree 융합 단백질은 OID 분획에서 뚜렷한 밴드로 검출됩니다. 적절한 농도의 crew recombination을 사용하려면 Redford 분석을 통해 농도를 결정해야 합니다.

포유류 세포에 영구적 단백질을 도입하는 방법입니다. 우선, 최고 수준의 단백질 도입 효율을 얻기 위해 표적 세포를 준비하십시오. 표적 세포가 조밀한 군락을 형성하며 성장하는 세포인 경우, 다음 날 80~90%의 합류도(confluence) 세포층이 형성될 수 있는 밀도로 단층 세포를 준비하십시오.

5시간 전에 세포를 분리 및 체세포화하여 단일 세포 현탁액 상태로 만듭니다. 단백질 형질전환 전에 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 콜로니 표면의 세포만 형질전환될 수 있기 때문입니다. 배지를 흡입하고, 트립신 처리 전 PPS로 세포를 잠시 관찰합니다.

혈청이 포함된 잔여 조제 배지를 제거합니다. PPS 오버레이를 흡입한 후, 세포가 흘러내리도록 하여 3~5분 동안 배양합니다. 이제 현미경으로 확인하여 모든 콜로니가 단일 세포로 분해되었는지 확인합니다.

앞서 언급한 이유들로 인해, 이 과정은 yeast 세포로의 단백질 형질전환을 위한 매우 중요한 단계입니다. 분리된 세포를 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리기 거치대에 넣고 원심분리하여 세포를 침강시킵니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 재현탁합니다.

성장 배지로 세포를 희석하여 적절한 세포 수로 맞춥니다. 이는 당연히 조직 배양 접시의 크기에 따라 달라집니다. 배양 접시에서 세포를 5시간 더 추가로 배양합니다.

이렇게 하면 공기 세포가 바닥에 부착되어 부착성으로 성장할 수 있는 충분한 시간이 확보됩니다. 3-class row stock은 -20°C에서 2년 이상 보관할 수 있습니다. 재조합 세포 영구 융합 단백질을 다룰 때, 필요에 따라 사용할 수 있는 이러한 스톡 용액을 보유하는 것은 매우 유용합니다.

세포가 디쉬에 부착되기를 기다리는 동안, 적정 부피의 C transduction protein stock을 배지에 희석하여 transduction 배지를 간단히 준비할 수 있습니다. Stock 용액이 아직 멸균 상태가 아니므로, 배지를 적용하기 전에 반드시 멸균 필터를 사용해 여과해야 합니다. 단백질 결합 필터가 장착된 시린지를 사용할 것을 권장합니다.

최종 creek 농도는 세포 유형이나 배지 보충제에 따라 달라집니다. 예를 들어, 혈청은 형질도입 효율에 강한 부정적인 영향을 미칩니다. 이는 혈청이 없는 배지를 사용하거나 creek 농도를 높임으로써 극복할 수 있습니다.

최고의 재조합 효율을 가능하게 하는 최적 조건을 확인합니다. 하이드레이트 농도를 0.5에서 10 µM까지 설정하십시오. 6시간에서 18시간 사이의 다양한 배양 시간을 테스트하는 것을 권장합니다.

5시간 동안 배양한 후, 대상 세포를 꺼내 교차 배지를 흡입하여 제거합니다. 이어서 이를 단백질 형질전환 배지로 교체하고, 세포를 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. D 세포를 PBS로 가볍게 세척한 후, 단백질 형질전환 배지를 일반 ES 배지로 교체합니다.

세포 배양 48시간 후, XUL을 통해 Cre 재조합 효소 유전자의 영구적 발현을 검출할 수 있습니다. 양성 $\beta$-gal 표현형을 보이는 염색 세포들은 부위 특이적 재조합에 의해 유전 공학적으로 성공적으로 변형되었음을 나타냅니다. Cre 리포터.

세포들은 전매개 재조합 시 Lae 컨스트럭트를 사용하여 CRE를 보유합니다. LoxP 플랭크 스톱 서열이 절단되고, team 프로모터에 의해 luxe 리포터 유전자가 활성화됩니다. 전처리된 리포터 공기 세포의 재조합 효율을 평가하기 위해 세포를 고정해야 합니다.

배지를 흡입하고 PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 4% PFA로 세포를 덮고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 PBS로 세포를 다시 세 번 세척합니다. 마지막 세척 단계에서 PBS를 흡입한 후, 웰에 Xal 염색 용액을 첨가하고 인큐베이터 내 37°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.

다음 날, 파란색 칼라(collar) 세포를 통해 Beal 활성을 모니터링할 수 있습니다. 재조합 효율은 파란색 콜로니의 수로 결정할 수 있습니다. 최적의 조건에서는 90% 이상의 재조합 효율을 달성할 수 있습니다. 지금까지 E. coli로부터 부위 특이적 쿼리 재조합을 발현하고 정제하는 방법을 살펴보았습니다.

본 개념 증명 연구에서, 우리는 대부분의 염에서 재조합을 유도할 수 있었습니다. 이것으로 마치겠습니다. 실험에 행운이 따르길 바랍니다.