Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

다광자 형광 광퇴색 후 회복(multi photon fluorescence recovery after photobleaching) 절차는 자유롭게 확산되는 형광 염료 분자 시료를 통해 쉽게 입증할 수 있습니다. 먼저, 저강도 레이저 빔을 시료에 조사하여 레이저의 초점 부피 내에 있는 D 분자로부터 기준 형광 수준을 생성합니다.

다음으로, 짧고 강한 고강도 레이저 플래시를 조사하여 초점 부피 내 염료 분자의 일부를 광퇴색시킵니다. 마지막으로, 레이저 빔을 이전의 저강도 수준으로 감쇄시키고, 광퇴색된 분자들이 외부로 확산되고 초점 부피 외부의 여전히 형광을 띠는 분자들이 그 자리를 대체함에 따라 형광 변화를 모니터링합니다. 이렇게 얻은 시간 함수에 따른 형광 곡선을 분석하여 확산 계수를 산출합니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 생명공학과 Edward Brown 교수님 연구실의 Kelly Sullivan입니다. 오늘은 다광자 형광 광퇴색 후 회복(multi photon fluorescence recovery after photobleaching) 실험 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 기술을 사용하여 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 생물학적 시스템에서의 확산을 연구하고 있습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 우선 원하는 레이저 파장을 설정하고 광전증배관 또는 PMT 앞에 적절한 필터를 삽입하십시오. 다음으로, pcal 셀의 손상을 방지하기 위해 레이저 출력을 200 milliwatts 이하로 조정하십시오.

pcal 셀 상류에 숫자 4 모양으로 배치된 두 개의 거울이 있습니다. 이 거울들은 레이저 빔을 pcal 셀에 맞추는 데 필수적이며 충분합니다. pcal 셀 바이어스 컨트롤러의 전압 오프셋을 0으로 설정하고, 레이저가 전면 및 후면 창의 중심에 오도록 pcal 셀을 통과하는 레이저 경로를 조정하십시오.

그림 4의 상류 측 거울을 사용하여 빔을 전면 창의 중앙에 맞추고, 그림 4의 하류 측 거울을 사용하여 빔을 후면 창의 중앙에 맞추십시오. 이제 pcal 셀 결정에 인가하는 전압을 최대값으로 설정하십시오. 적절한 값은 파장에 따라 다르며 pcal 셀 사용 설명서에서 확인할 수 있습니다.

pcal 셀 상류의 그림 4에 표시된 거울들을 조정하여 pcal 셀의 출력 전력이 최대가 되도록 합니다. 이제 결정에 인가되는 전압을 0으로 전환하고, 바이어스 컨트롤러의 전압 오프셋을 조정하여 pcal 셀의 출력 전력을 최소화하십시오. pcal 셀에 입사되는 레이저 전력을 실험에 필요한 값으로 되돌립니다.

이제 현미경으로 이동하여, 표준화된 형광 시료의 초점을 정확하게 맞춥니다. 여기서는 고정된 형광 꽃가루 입자를 사용합니다. 초점이 맞춰지면 현미경을 밀봉하고, pcal 셀 결정의 전압을 변경하여 시료 이미징에 적절한 수준으로 레이저 출력을 조정하십시오.

마지막으로, 조명을 끄고 PMT를 켭니다. 표준 시료의 반복 이미지 스캔을 시작하고, 시료의 선명한 이미지가 얻어질 때까지 pcal 셀 하류의 미러를 조정합니다. 이제 시료 내 초점에서의 안전한 모니터 전력을 결정하는 방법을 살펴보겠습니다.

본 영상에서는 유리 슬라이드의 오목한 부분에 담겨 커버 슬립으로 덮인 수성 염료 샘플을 사용하겠습니다. 샘플 내에서 형광이 생성될 수 있도록 레이저 출력을 낮으면서도 적절한 수준으로 조절하십시오. 현미경을 밀폐하고, PMT의 출력을 광자 계수기로 전환하십시오.

조명을 끄고 PMT를 켠 다음, 현미경 소프트웨어에서 포인트 스캔을 시작하십시오. 광자 계수기가 예상 형광 회복 시간보다 훨씬 긴 시간 범위에서 적분하도록 설정하고 적절한 수의 데이터 포인트를 기록하십시오. 출력을 높여 광자 계수 데이터 시리즈를 추가로 측정하십시오.

광자 수의 증가가 상당히 감소하는 것처럼 보일 때까지 계속해서 출력을 높이십시오. 출력 증가 그래프에서 광자 수의 로그값을 출력의 로그값에 대한 함수로 나타냅니다. 기울기가 2에서 벗어나는 모든 편차는 광퇴색(bleaching)을 나타냅니다.

모니터링 중에 이 컷오프 값보다 낮은 적절한 모니터 전력을 선택하십시오. 이제 다채널 스케일러와 펄스 발생기에 입력할 파라미터를 결정하겠습니다. 펄스 발생기에서 설정합니다.

스케일러에서 사전 조사(pre-teach) 시간을 예상 반 회복 시간의 1~2배로 설정하고, 표백(bleach) 시간은 예상 반 회복 시간의 1/10로 설정하십시오. 빈 너비(bin width)는 표백 지속 시간의 약 절반으로 설정하고, 레코드당 빈 수를 설정하여 선택한 빈 너비와 레코드당 빈 수의 곱이 예상 전체 회복 시간보다 크게 하십시오. 사전 조사 및 표백 시간을 더한 후 펄스 발생기로 돌아가, 사전 조사 및 표백 시퀀스의 주파수를 빈 너비와 레코드당 빈 수의 곱의 역수보다 약간 작은 값으로 설정하십시오.

마지막으로, 선택한 모니터 출력에서의 신호 강도에 따라 스케일러의 스캔당 레코드 수를 설정하십시오. 이제 모니터 출력을 안전한 수준으로 설정하고, 표백 출력은 모니터 표백 테스트 중에 결정된 표백 컷오프보다 약 200 milliwatts 높게 설정하십시오. 이 출력들은 모두 al 셀 결정 씰에 가해지는 서로 다른 전압으로 설정되며, 현미경 조명은 끈 상태여야 합니다.

PMT를 켭니다. 이미지 소프트웨어에서 포인트 스캔을 시작하십시오. 그런 다음 펄스 발생기와 스케일러를 작동시킵니다.

결과로 얻어진 회복 곡선을 분석하기 위해 세 가지 중요한 지점을 표시하십시오. 표백 전 형광, 표백 직후의 형광, 그리고 데이터 세트 끝의 형광입니다. 표백 전과 직후의 형광 값을 사용하여 반감기 회복 시간을 더 정확하게 추정하십시오.

이제 이전 단계에서 설명한 규칙을 사용하여 preble bleach 및 begin width 지속 시간 값을 업데이트하십시오. 새로운 곡선을 생성하고 결과 곡선에서 강한 bleach와 매끄러운 recovery가 나타날 때까지 파라미터를 계속 조정하십시오. power의 로그 값에 따른 bleach depth 파라미터의 로그 값을 플롯하여 여기 포화(excitation saturation) 여부를 확인하십시오.

기울기가 2에서 벗어나는 모든 경우는 여기 포화(excitation saturation)를 나타냅니다. 강한 표백을 유도하되 포화를 일으키지 않는 표백 강도를 선택하십시오. 마지막으로, 적절한 파라미터가 결정되면 관심 시료의 다광자 형광 회복 분석(multi photon fluorescence recovery after photobleaching 또는 MP FRAP) 곡선 측정을 계속하십시오.

이제 원시 MP FRAP 데이터와 이에 맞게 피팅된 정규화된 MP F wrapp 곡선의 대표적인 결과들을 보여드리겠습니다. 확산 계수를 확인하기 위해, 원시 MP F FRAP 데이터는 강한 광퇴색과 매끄러운 회복 양상을 보입니다. 데이터 피팅을 위해 데이터의 후반부에서 전체 회복이 보고되었습니다. 먼저 회복도를 광퇴색 전 평균 형광 값으로 정규화한 다음, 비선형 최소제곱법 피팅을 수행합니다.

적절한 모델에 대하여, 두 데이터 세트 모두 수성 플루오레세인(fluorescein)에서 측정되었으며 확산 계수를 산출하였습니다. 문헌 내용과 일치하며, 지금까지 다광자 형광 광퇴색 후 회복 실험을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때는 주의를 기울여 실험 파라미터를 설정하는 것이 중요하며, 특히 표백 시간과 표백 및 모니터링 강도를 프로토콜에 정의된 안전 범위 내로 설정해야 합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.