자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

저산소 인서트 장치는 6-웰 플레이트의 웰에 끼워지는 6개의 필라로 구성되어 있습니다. 가스는 필라 하단의 미세 유체 네트워크를 통해 흐르며, 가스 네트워크와 배양 배지를 분리하는 가스 투과성 PDMS 막을 통해 확산될 수 있습니다. 이 장치는 산소원인 필라 하단의 미세 유체 네트워크와 세포 사이의 확산 경로 길이를 최소화하여 산소 농도의 더 빠른 평형화를 가능하게 합니다.

또한 이 장치는 포토마스크를 이용한 표준 포토리소그래피로 제작된 미세유체 가스 네트워크 설계에 의해 결정되는, 세포에 노출되는 산소의 공간적 패턴을 훨씬 더 세밀하게 제어할 수 있게 해줍니다. 안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 바이오공학과 David Edington 교수님 연구실의 Sean Ard입니다. 안녕하세요, 저도 Edington 연구실 소속인 Ellie입니다.

오늘은 6-well 플레이트 내의 인비트로(in vitro) 세포 배양물을 서로 다른 산소 농도에 노출시키기 위한 맞춤형 장치를 제작, 검증 및 활용하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 상처 치유, 활성 산소종 생성 및 이동에 산소가 미치는 영향을 연구하기 위해 이 절차를 사용해 왔습니다. 그럼 시작하겠습니다.

산소 공급 인서트를 제작하기 위해, 전구체(prepolymer)와 경화제(curing agent)를 10:1 비율로 섞어 Polymethyl Sloane 또는 PDMS를 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라, PDMS 혼합물을 표준 6-웰 배양 플레이트의 모양을 모방하여 가공된 Delrin 몰드에 붓습니다. 75 °C에서 하룻밤 동안 경화시키면, 결과물로 얻어진 복제 몰드 필러 어레이(pillar array)가 산소 공급 인서트를 구성하는 세 가지 구성 요소 중 첫 번째 요소가 되며, 이를 통해 산소 공급 인서트를 제작하기 위한 두 번째 핵심 구성 요소를 제작할 수 있습니다.

먼저 SU 8 21 50을 스핀 코팅하여 SU 8 마스터를 준비합니다. 실리콘 웨이퍼에 포토마스크를 적용하고, 포토마스크를 통해 SU 8을 UV에 노출시켜 마이크로채널 두께가 300 µm인 마스터 몰드를 제작합니다. SU 8 마스터 위에 PDMS를 붓고 75 °C에서 2시간 동안 경화시켜, 최종적으로 각 필러 하단에 마이크로채널을 형성하게 될 양각 몰드를 얻습니다.

장치의 세 번째 구성 요소는 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS를 500 RPM으로 10초 동안 스핀 코팅한 후, 900 RPM으로 30초 동안 추가 코팅하여 100 µm 두께의 멤브레인을 제작함으로써 만들어집니다. PDMS는 가스 투과성이 있으므로, 이 멤브레인을 통해 마이크로 채널로 산소를 직접 공급할 수 있습니다. 모든 구성 요소가 준비되면, 각 접합 표면을 1분 동안 산소 플라스마 처리합니다.

휴대용 플라스마 장치를 사용하여 먼저 6개의 마이크로채널 구성 요소를 필라 어레이에 접합한 다음, 각 필라에 두 개의 구멍을 뚫어 가스 유입구 및 유출구로 사용합니다. 마지막으로, 접합을 용이하게 하고 기포를 배출하기 위해 마이크로채널 바닥에 멤브레인을 접합합니다. 플라스마 처리된 표면은 핀셋 끝을 사용하여 약 1분 동안 함께 누릅니다. 각 접합 단계 사이에 1시간 동안 기다려 장치가 완전히 접합되고 교정될 수 있도록 합니다.

장치 제작이 완료되면, 실제 실험에서 산소 공급 인서트를 사용할 때 세포가 받는 산소 수치를 보정해야 합니다. 보정을 위해 산소에 의해 소광되는 형광 루테늄 염료 코팅이 포함된 형광 산소 센서 또는 foxy slide를 사용하십시오. Foxy slide는 6-웰 플레이트 바닥에 맞게 미리 절단되어 있습니다.

foxy 슬라이드는 웰 표면을 최대한 많이 덮을 수 있도록 절단해야 합니다. foxy 슬라이드의 두께가 약 1mm이므로, 적절한 막 확산을 위해 원하는 거리를 유지하도록 장치를 수정하십시오.

이 거리는 실험에 따라 달라지지만, 대부분의 경우 핸드헬드 플라즈마 장치를 사용하여 1mm 미만으로 유지해야 합니다. 두께 1mm의 유리 현미경 슬라이드를 길이 약 6mm, 너비 4mm의 포스트 형태로 절단하여 장치 바닥에 부착하십시오. 장치는 슬라이드 절단면 위의 포스트에 거치됩니다.

산소 소모량을 검증하기 위해 0.17 millimeters의 확산 간격을 형성하는 유리 커버 슬립을 사용할 수도 있습니다. 산소를 측정할 6-웰 플레이트의 웰에 실온의 탈이온수를 3 milliliters씩 넣습니다. 장치를 플레이트에 배치하고 metamorph 소프트웨어를 사용하여 foxy 센서에서 원하는 위치의 번호와 지점을 선택합니다.

산소 농도를 측정하기 위해 슬라이드를 준비합니다. 산소 가스 탱크와 저산소 삽입 장치 사이에 타이 건 튜브를 연결합니다. 전달되는 가스를 정밀하게 제어하기 위해 분당 50에서 100 milliliters의 유량으로 설정된 정밀 유량 조절기를 사용합니다.

정밀 유량 조절기가 닫혀 있는지 확인합니다. 탱크 상단 조절기를 먼저 열고, 이어서 정밀 조절기를 엽니다. 15분 후에 유량을 분당 10에서 20 사이로 줄입니다.

물속에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해, 향후 1시간 동안 유량 값을 면밀히 관찰하고 필요에 따라 조정하십시오. 시스템이 평형 상태에 도달하는 동안 압력 강하가 변하여 플레이트와 foxy 센서의 이미지를 캡처하기 위한 유량이 변경될 수 있기 때문입니다. 형광 장치가 장착된 Olympus IX 71 현미경, Q Imaging Tiga의 전하결합소자(CCD) 카메라, SRV 및 Metamorpho 이미지 획득 소프트웨어가 사용됩니다. 현미경에는 들뜸 파장 475 nanometers 및 방출 파장 600 nanometers의 foxy 호환 형광 필터인 Olympus 3 1 0 2 0가 장착되어 있습니다.

장치의 평형 도달 시간과 산소화 정도를 테스트하려면, foxy 슬라이드에서 산소 농도를 측정할 세 지점을 선택하십시오. 가스 흐름을 시작하기 직전에 슬라이드의 이미지를 캡처하십시오. 가스가 장치를 통해 흐르는 동안 30분 동안 10초 간격으로 이미지를 캡처하여 불균질성과 산소 전달력을 테스트하십시오.

채널 너비에 걸쳐 1 mm 간격으로 여러 지점을 설정하고, metamorph를 사용하여 웰 표면의 산소 농도를 측정합니다. 각 위치의 평균 이미지 강도를 내보내고, 형광 강도에 따른 산소 농도를 그래프로 나타냅니다. 형광 강도와 산소 농도의 관계를 나타내는 0~10% 구간과 10~21% 구간에 선형 곡선을 피팅하여 검정 곡선을 생성합니다. 측정된 각 위치의 원시 강도 데이터는 metamorph에서 내보낸 후 Microsoft Excel 또는 기타 통계 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석할 수 있습니다.

장치 보정이 완료되면 상처 치유 분석과 같은 실험을 시작할 수 있습니다. 실험 전 24시간 이내에 보정된 인서트를 121 °C에서 15분 동안 오토클레이브로 멸균하고, 이후 오염을 방지하기 위해 라미나 플로우 배양 후드 내에서 작업하십시오. 플레이트 웰에 삽입할 때 기포가 발생하는 것을 억제하기 위해 멸균된 PDMS 인서트를 무혈청 배지에 24시간 동안 담가 둡니다. 6웰 플레이트에서 MDCK 세포 또는 기타 부착성 세포를 100% 합류도(confluency)까지 배양한 후, P 200 피펫 팁을 사용하여 단일층에 직선형 스크래치를 만듭니다. 이 스크래치는 부착성 단일층의 상처를 모사합니다.

단일층이 손상되지 않도록 세포 배지를 흡입하여 제거하고 5 mL의 배지로 헹굽니다. 다시 흡입하여 제거한 후, 웰에 3 mL의 무혈청 배지를 채웁니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 장치를 플레이트에 천천히 삽입합니다.

장치를 삽입할 때 각도를 조절하면 기포를 한쪽으로 배출하는 데 도움이 됩니다. 장치에 과도한 압력이 가해지지 않도록 주의하십시오. 압력이 너무 세면 PDMS가 변형되어 하단의 세포가 손상될 수 있습니다. 플레이트와 장치를 37 °C로 가열된 현미경 스테이지 위에 올리고, 소스 가스 탱크에서 나오는 튜브를 장치의 입구 및 출구 포트에 연결하십시오.

배양 인큐베이터에는 튜브가 들어갈 수 있는 구멍이 있어야 하며 튜브가 연결되어 있어야 합니다. 장치를 인큐베이터에 넣은 후, 이전에 설명한 것과 동일한 가스 흐름 시작 절차를 수행하여 상처 치유를 평가합니다. 이전에 설명한 장비와 이미징 소프트웨어를 사용하여 15~18시간 동안 20분마다 세포의 타임랩스 이미지를 캡처합니다. T scratch 상처 측정 알고리즘을 사용하여 원하는 실험 기간 후의 미치유 표면적을 분석할 수 있습니다. 가스 흐름을 중단하고 플레이트를 제거한 뒤, 필요한 경우 추가적인 세포 처리 과정을 진행합니다. 저산소 인서트 장치는 여기에서 보는 바와 같이 0.5% oxygen으로 안정화되는 데 2분 미만이 소요됩니다.

장치 멤브레인 웰 바닥의 간격 크기는 평형 효율을 결정하는 중요한 요인이었으며, 간격이 클수록 정상 상태의 산소 농도 값에 도달하는 데 더 많은 시간이 필요했습니다. 또한 이 장치는 단일 웰 내의 공간적 산소 공급을 정밀하게 제어할 수 있어, 다양한 조건의 형성이 가능하며 웰 표면에 걸쳐 주기적인 산소 프로파일을 생성할 수도 있습니다. MDCK 세포 단층을 10% 또는 21% 산소에 노출시켰으며, MATLAB Ts scratch wound tailing 알고리즘을 사용하여 상처 부위의 표면적을 시간에 따라 분석하였습니다.

총 17시간 중 11시간이 경과했을 때, 10% oxygen에 노출된 경우 원래 상처의 6.87%가 남아 있었던 반면, 21% oxygen 조건에서는 상처의 64.4%가 남아 있었습니다. 여기서 보시는 바와 같이, 두 oxygen 농도 모두에서 oxygen 농도는 상처 개방 면적과 음의 상관관계를 보입니다. 본 실험 기간 동안, 저희는 scratch wound healing assay를 위한 저산소 insert 장치를 제작, 검증 및 활용하는 방법을 보여드렸습니다. 이 장치는 실험실 내 점유 면적이 작고 세포 표면의 공간적 및 시간적 oxygen 조절 능력이 훨씬 뛰어나다는 점에서 다른 oxygenation 시스템보다 여러 가지 장점을 제공합니다.

이 장치는 in vitro 세포 배양에 미치는 산소 또는 이산화탄소와 같은 다른 가스의 영향을 연구하는 거의 모든 실험실에서 활용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 멸균된 장치와 배양액을 하룻밤 동안 담가두어 실험 중 기포 형성을 최소화하는 것이 중요합니다. 또한, 실험을 시작하기 전 시스템이 평형 상태에 도달하도록 하십시오.

이는 시스템 내의 압력이 평형을 이룸에 따라 유속이 변하기 때문입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.