머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

본 절차에서는 형광 표지된 RNA 전사체를 Xenopus oocytes에 주입하고 그 국소화를 모니터링합니다. 먼저, RNA를 형광 뉴클레오타이드로 표지합니다.

인비트로(in vitro) 전사 반응 후, RNA를 미세주입 장치에 로딩합니다. 난모세포를 주입용 접시에 놓고 주의 깊게 미세주입합니다. 마지막으로, 공초점 현미경으로 이미징하기 전 RNA 국소화가 일어날 수 있도록 난모세포를 배양합니다.

안녕하세요, 저는 브라운 대학교 분자생물학, 세포생물학 및 생화학과의 Kimberly Mallory 박사 연구실 소속 James Gagnan입니다. 오늘은 Xenopus 난모세포에서 세포 내 RNA 국소화를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 초기 척추동물 발달 과정 중 RNA 국소화에 필요한 RNA 구조와 단백질 인자를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 함께 제공된 서면 프로토콜에 기술된 대로 방사성 및 형광 표지가 모두 된 mRNA를 전사하십시오. 템플릿 DNA를 분해하기 위해 DNase를 첨가한 다음, EDTA를 첨가하여 반응을 중단시키십시오.

G 50 컬럼을 이용해 원심분리하여 결합되지 않은 뉴클레오타이드와 기타 작은 분자들을 제거합니다. 그 다음 에탄올 침전법으로 RNA를 농축하고, 세척 후 재현탁합니다. 신틸레이션 계수법(scintillation counting)으로 농도를 측정한 후, RNA를 50 nM로 희석하여 5 µL씩 분주해 -80 °C에서 보관합니다.

미세주입을 수행할 준비가 되면, 표지된 RNA의 aliquote를 해동하고 70°C에서 5분 동안 변성시킵니다. 그다음, 실온의 원심분리기에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리하여 입자성 물질을 제거하고 얼음 위에 보관합니다. 이어서, 3mg/mL 농도의 용액 25mL가 담긴 50mL 원뿔형 튜브에 Xenopus laevis 난소 조각을 잘라 넣어 난모세포를 분리합니다.

pH 7.4의 0.1 M 인산칼륨 완충액에 포함된 콜라게나아제. 배치 간 편차가 있으므로 18 °C에서 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 콜라게나아제 처리 시간은 달라질 수 있으므로 육안 검사를 통해 주의 깊게 모니터링해야 합니다.

탈엽(defoliation)이 확실히 이루어지도록 15분 동안 또는 난모세포가 난소로부터 눈에 띄게 분리될 때까지 계속 흔들어 준 후, 난모세포가 원심분리관 바닥에 가라앉도록 둡니다. 용액을 제거하고 MBSH 버퍼로 교체합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

다음으로, 표준 광학 현미경 하에서 3~4단계의 CYTES를 수동으로 분류하여 MBSH 버퍼에 담습니다. 3단계 cytes는 완전히 불투명하며 흰색입니다. 반면 4단계 cytes는 크기가 약간 더 크고 색소가 섞여 점무늬가 있습니다.

약간 투명한 난모세포는 너무 미성숙하며, 완전히 색소가 침착되었거나 색소 분포가 편향된 난모세포는 너무 성숙한 상태입니다. 마지막으로, 3.5인치 모세관을 당기고 베벨링하여 외경이 약 0.05 millimeters인 니들을 제작해 미세주입을 준비합니다. 이제 mRNA, 난모세포, 니들이 모두 준비되었으므로 미세주입을 진행합니다.

먼저 주입 1회당 2nm가 주입되도록 3차 증류수로 니들을 보정합니다. 가스 제어 마이크로 인젝터를 사용하여 니들에 액체를 충전하고 마이크로미터를 이용해 방울 크기를 보정하십시오. 보정이 완료되면 주입할 RNA를 니들에 충전합니다. 다음으로, 분리된 난모세포를 MBSH 완충액이 담긴 주입용 디시 위에 놓습니다. 이때 디시에는 검은색 폼 고무 층이 포함되어 있어야 합니다.

검은색 배경에서 흰색 난세포가 뚜렷하게 보입니다. 그런 다음 각 난세포에 50 nanomolar 농도의 RNA 2 liters를 조심스럽게 주입하십시오. 각 난세포에는 한 번만 주입해야 하며, 주입이 완료되면 바늘에 막힘이 없는지 정기적으로 확인하십시오.

남은 RNA를 배출하고, 니들을 증류수로 헹군 다음 주입할 다음 RNA를 로딩하십시오. 주입 후, 주입된 난세포를 멸균된 24-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 웰당 최대 1,000개의 난세포를 배양할 수 있습니다.

버퍼를 제거하고 웰당 400 µL의 cyte 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 배양 중 습한 환경을 유지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어 있는 플라스틱 용기에 배양 플레이트를 넣고, 원하는 배양 기간에 따라 8시간에서 48시간 사이의 시간 동안 oocyte를 18 °C에서 배양합니다. 주입된 oocyte의 배양이 완료되면 현미경 관찰을 위한 준비 과정을 진행할 수 있습니다.

사멸한 난모세포를 골라내고 생존한 난모세포를 유리 바이알에 넣습니다. 통상적으로 난모세포의 90% 이상의 생존율이 관찰됩니다. 버퍼를 M-E-M-F-A 고정액으로 교체하고 세포를 20분 동안 흔들어 줍니다.

고정 기간이 끝난 후, 고정 과정 중에 난모세포가 햇빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 고정액을 제거하고 동일한 부피의 MBSH 완충액으로 교체하여 난모세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번 세척합니다.

다음으로, 난모세를 무수 메탄올로 세척합니다. 먼저, 부피의 절반을 제거하고 메탄올로 채웁니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다.

이러한 세척 과정 후에 모든 용액을 제거하고 메탄올로 교체합니다. 이 메탄올 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 고정 및 탈수된 난모세포는 이미징 준비가 될 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

이미징 전에, 이미징 표면을 덮을 수 있도록 glass bottom WPI fluoro dish에 Marie's clearing medium을 추가합니다. 메탄올에서 fluoro dish로 난모세포를 조심스럽게 옮기되, 함께 옮겨지는 메탄올의 부피를 최소화하십시오. 도립 공초점 현미경으로 난모세포를 이미징하며, Zeiss LSM 510과 Leica TCS SP 모두 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 이제 미세주입 직후의 세포 내 RNA 국소화 대표 이미지들을 보여드리겠습니다. 형광 표지된 대조군을 8시간 동안 배양한 후에는 핵 내에서 형광 RNA를 확인할 수 있습니다.

RNA가 난모세포의 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 운송 장치를 모집하는 서열을 포함하고 형광 표지된 RNA는 난모세포의 식물극으로 세포 내 국소화되는 과정을 확인할 수 있습니다. 지금까지 형광 표지된 RNA를 zap cytes에 미세 주입하고 공초점 현미경으로 RNA 국소화를 관찰하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 배양액의 RNA 오염을 방지하기 위해 DEPC 처리된 용액을 사용하고, 항생제가 포함된 OCM에서 난모세포를 배양하며, 광퇴색을 방지하기 위해 가능한 한 난모세포를 햇빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.