향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

안녕하세요, 저는 펜실베이니아 대학교 세포 및 발생 생물학과의 Shannon Fisher 교수 연구실의 Erica Kgi입니다. 저 또한 Fisher 연구실의 Chris Weber입니다. 그리고 저는 Shannon Fisher입니다.

오늘은 제브라피시 형질전환을 이용하여 인핸서 요소의 기능을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 이 절차를 통해 골격 발달에 중요한 유전자들의 전사 조절을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다.

후보 유전자 주변의 비부호화 서열을 식별하기 위해, uc SC 게놈 브라우저의 트랙으로 제공되는 fast cons 알고리즘을 사용합니다. 본 연구에서는 주로 골격 발달 과정에서 발현되는 유전자에 관심을 두었으나, 동일한 접근 방식을 사용하여 초기 발달 단계에서 발현되는 모든 유전자를 연구할 수 있습니다. 여기에 제시된 예시에서는 보존된 서열을 식별하였습니다.

인간 bumper 유전자를 둘러싼 구간에서, 인접한 유전자들까지 포함한 전체 구간을 조사하여 비코딩 서열의 상위 약 5%에 해당하는 낮은 크기 특이적 로그 점수 컷오프(log score cutoff)를 결정합니다. 서열을 선택한 후, Primer3를 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 각 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계합니다. 프라이머는 보존 영역과 그 양측으로 30bp 이상의 염기쌍을 더 증폭할 수 있도록 선택해야 합니다. 고품질 중합효소를 사용하여 인간 게놈 DNA로부터 관심 영역을 증폭하고, 표준 실험실 분자생물학 절차를 사용하여 증폭된 산물을 발현 벡터에 클로닝합니다.

본 프로토콜에서 사용된 벡터는 PG wc FOS GFPA gateway입니다. 목적 벡터(Destination vector)이며, 벡터 제작 후 전치(transpose)하도록 안내되었습니다.

전이(transposition)에 필요한 효소는 실험적 주입 전, Ambion의 M message M machine 키트와 PGB 600 플라스미드를 사용하여 먼저 인비트로(in vitro)에서 전사합니다. mouse socks. 10 enhancer와 같이 효능이 알려진 인핸서를 함께 주입하여 각 트랜스포스(transposes) 배치의 효능을 테스트합니다.

주입 준비를 위해, Sutter P 97 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1.2 millimeter od 필라멘트 모세관 유리에서 미세주입용 바늘을 뽑아냅니다. 깨끗한 면도날과 마이크로미터 슬라이드를 사용하여 손상되지 않은 난막(corion)을 깨끗하게 관통할 수 있도록, 팁이 튼튼하고 테이퍼가 날카롭게 형성되는 프로그램을 사용하십시오. 스테레오 현미경 하에서 손으로 팁을 부러뜨려 외경이 약 15 micrometers가 되도록 조절합니다.

니들은 덮개가 있는 보관 접시에 하루 동안 보관할 수 있습니다. 미세 주입을 수행하기 전날, 제브라피쉬 개체군을 표준 조건 하에 14시간의 광주기가 포함된 규칙적인 명암 주기에서 유지하십시오. 시간 맞춤 교배를 위해 작은 교배 탱크에 물고기를 준비하십시오.

미세 주입을 실시하는 날 아침, 명기가 시작된 직후 각 수조에 암컷 3마리 또는 수컷 2마리를 평행하게 배열하여 배치합니다. 알 생산을 위해 깨끗한 시스템 처리수에 수컷과 암컷을 함께 넣습니다. 물고기를 빈번하게 확인하고, 동기화가 잘 된 배치를 얻기 위해 산란 후 몇 분 이내에 알을 수집합니다.

오전 내내 라텍스 벌브가 장착된 5.25인치 광구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 물고기 그룹을 계속해서 합치면서 2~3시간 동안 알 생산을 유지합니다. 수집된 배아를 배아 배지가 일부 채워진 60 x 15mm 페트리 접시에 배아 50개씩 그룹으로 나누어 분배합니다. 각 접시의 뚜껑에 수집 시간을 기록합니다.

수집된 각 배아 클러치에 대해, 알 수집 단계 사이에 주입하지 않은 대조군으로 사용할 배아 50개가 담긴 디쉬를 따로 보관하십시오. 마이크로 원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합하여 신선한 주입 용액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 주입 바늘을 홀딩 디쉬에 놓고 1.5에서 2 µL의 주입 용액을 채우십시오.

각 바늘의 넓은 끝부분에 500 nanoliter 방울을 피펫팅합니다. 액체는 모세관 현상에 의해 팁 쪽으로 끌려 올라갑니다. 각 주입 용액당 최소 두 개의 바늘을 준비하십시오.

충전된 니들을 공압식 피코 펌프(pneumatic pico pump) 또는 유사한 압력 주입기의 핸드헬드 니들 홀더에 장착합니다. 제조사의 지침에 따라 질소 탱크에 구성 및 연결하십시오. 마이크로미터 슬라이드 위의 미네랄 오일로 배출된 액적의 직경을 측정하여 주입량을 교정하며, 주입 시간은 통상적으로 120 milliseconds로 설정합니다.

20 PS의 압력으로, 6~10배 배율의 실체 현미경을 사용하여 약 1 nl의 액적을 생성합니다. 미세 핀셋으로 배아를 고정한 후, 1세포기 또는 초기 2세포기 배아의 난황 속으로 주사 바늘을 일정하게 밀어 넣어 난막을 통과시킵니다. 바늘 끝을 할구 바로 아래 난황에 위치시킨 후, 약 1 nl의 주입 용액을 배출하고 바늘을 뽑아냅니다. 각 제작물에 대해 200개 이상의 배아에 주입합니다. 주입이 완료되면 수정되지 않은 알, 손상된 배아, 주입에 실패한 배아 또는 할구에 phenol red가 없는 배아를 제거하여 배아를 분류합니다.

그 다음, 배아와 배아 배양액을 관찰하기 적절한 시간이 될 때까지 28.5 °C에서 배양합니다. 이제 제브라피쉬 배아에서 조직 특이적인 GFP 발현 패턴을 생성하는 인핸서 요소의 대표적인 결과 몇 가지를 보여드리겠습니다. 저희는 성장 과정 중 뼈나 연골에서 발현되는 유전자를 연구합니다.

수정 후 3일째에 두개안면 연골에서의 발현을 조절하는 acan 유전자 상류의 인핸서 요소 예시입니다. 여기에는 골세포에서의 발현을 조절하는 bumper 유전자의 또 다른 인핸서가 있습니다. 5일째에 우리가 확인한 많은 인핸서들 중에서, 유전자에 대한 상대적 위치와 발현 조절 사이에는 거의 상관관계가 없음을 발견했습니다.

테스트할 서열을 선택할 때, 인핸서는 이 배아에서 볼 수 있듯이 유전자의 상류 또는 하류 수백 kb 지점에 위치하거나 인트론 중 하나에 위치할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 상당수의 서열은 조직 특이적 발현을 조절하지 않는 것으로 보입니다. 이러한 서열들은 종종 형광이 거의 나타나지 않거나, 이소성 발현이 흔히 발생하는 두 부위인 표피와 골격근에서 소수의 세포가 흩어져 나타날 수 있습니다.

서열 보존성을 통해 잠재적 인핸서 요소를 식별하고 제브라피시의 모자이크 형질전환(Mosaic transgenesis)을 통해 그 기능을 테스트하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 주입에 사용할 DNA와 RNA의 품질을 확인하는 것이 중요합니다. 또한, 특히 소수의 세포군에서만 발현이 예상되는 경우에는 주입된 모든 배아를 주의 깊게 관찰하십시오.

이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.