붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

본 영상은 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cells, pbmc)를 자극하고 염색하는 절차를 보여줍니다. 다색 유세포 분석을 위해, 전혈에서 분리한 pbmc를 조직 배양 플레이트에 분주합니다. 세포에 화학적 또는 생물학적 자극을 주어 면역 반응을 유도합니다.

자극 후, 발현된 표면 마커를 기반으로 세포 유형을 식별하기 위해 항체 칵테일을 첨가합니다. 그 다음 세포를 투과화하고 다른 항체 칵테일을 첨가하여 세포 내 사이토카인의 발현을 검출하며, 이후 FACS로 분석하여 PBMC의 특정 하위 집단에 대한 사이토카인 프로파일을 결정합니다. 안녕하세요, 저는 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암센터 면역학과의 Dr. Jagan SAS 연구실 소속 에이미 코트니(Amy Courtney)입니다.

안녕하세요, 연구실의 홍입니다. 오늘은 T세포 반응의 다중 사이토메트리 분석 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 붉은털원숭이의 세포성 면역 반응을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. Trypan Blue 염색 제외법을 이용하여 Reuss Maca에서 추출한 PBMC의 생존 세포 수를 측정하기 위해 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 작업을 진행하십시오.

비특이적 자극을 위해 세포를 완전 배지에 1mL당 1천만 개의 세포 농도로 부유시킨 후, 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 부유액 100µL를 분주합니다. 그다음, PMA와 CIN이 포함된 배지 100µL를 첨가하여 최종 부피를 0.2mL로 맞추며, 이때 PMA의 최종 농도는 50ng/mL, CIN의 최종 농도는 500ng/mL가 되도록 합니다. 음성 대조군 웰에는 완전 배지만 100µL를 각각 첨가합니다. 세포를 37°C, 습윤화된 5% CO2 분위기에서 1.5시간 동안 배양합니다.

최종 농도가 10 µg/mL가 되도록 felden A를 배양액에 첨가하고 4.5시간 동안 추가로 배양합니다. 면역 염색 시 가시성을 높이기 위해 gold G 장치 내의 trapp 사이토카인에 felden A를 첨가합니다. 자극 후 원심분리하여 배지를 제거한 다음, 200 µL의 차가운 flow wash buffer를 첨가하여 세척하고 낮은 속도로 원심분리합니다. 이 세척 과정을 반복한 후, 50 µL의 flow wash buffer에 다시 현탁합니다.

이제 재현탁된 세포가 담긴 각 웰에 표면 마커 발현을 확인하기 위한 염색을 진행할 준비가 되었습니다. 제조사의 지침에 따라 준비한 live dead fixable aqua 형광 반응성 염료 1 µL를 첨가합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다.

마이크로 튜브에 FACS 분석에 사용할 염색 용액을 준비합니다. 먼저, 다음의 항목들을 적절히 포함하여 염색 칵테일을 준비하십시오. 적정된 형광 표지 단클론 항체(anti-CD3 PE SCI 7, anti-CD8 Alexa 700, anti-CD28 per CCP SCI 5.5, anti-CD95 APC 및 anti-CD4 Pacific Blue)와 Flow Wash Buffer입니다.

다음으로, 각 형광 접합 항체를 단색 염색으로 개별 튜브에 준비하여 다른 검출기로 유입되는 각 개별 염색의 스필오버 계수를 결정하는 데 사용할 보정 컨트롤을 준비합니다. 마지막으로, 관심 있는 시약을 제외한 모든 시약을 조합하여 형광 마이너스 원(Fluorescence Minus One, FMO) 염색을 준비합니다. 이는 완전 염색된 샘플에 존재하는 데이터와 자가형광 수준을 대조함으로써 양성 집단과 음성 집단 사이의 경계를 결정하는 데 사용됩니다.

세포를 live dead 염색액으로 배양한 후, 차가운 flow wash buffer로 한 번 세척하여 과잉 염료를 제거하고 wash buffer를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 준비된 염색 용액을 첨가합니다. 세포를 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다.

과량의 항체를 제거하기 위해 염색된 세포를 차가운 flow wash buffer로 세척합니다. 그 다음 BD fixation permeation solution 100 µL를 첨가하여 최소 10분 동안 반응시킵니다. 세포를 사용할 때까지 4 °C의 암소에 최대 24시간 동안 보관하거나, 세포 내 사이토카인을 염색하기 위해 다음 단계로 진행합니다.

먼저 1X perm. Wash buffer 100 µL로 세포를 투과화하고, 세포를 배양하는 동안 4 °C의 암소에서 10분 동안 배양하십시오. 이전과 같이 1X perm wash buffer를 사용하여 염색 항체, 보정 대조군(compensation controls) 및 FMO 대조군을 준비하십시오.

세포를 10분 동안 배양한 후, 원심분리하여 1x perm wash buffer를 제거합니다. 적절한 염색 항체를 첨가합니다. 그 다음, 세포와 항체를 4°C의 암소에서 60분 동안 배양합니다.

투과액으로 세포를 2회 세척합니다. 마지막 세척 후, 세포를 고정하기 위해 DPBS 내 1% Paraformaldehyde에 다시 현탁합니다. 세포를 사용 전까지 최대 24시간 동안 4°C의 암소에 보관하십시오.

세포 염색이 완료되면, LSR II 유세포 분석기 또는 Cytek DP 유세포 분석기를 사용하여 FACS를 수행합니다. 그 후 FlowJo 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. Rhesus macaque의 PBMC 구성은 FACS 분석을 통해 결정되었습니다.

이 그림은 대표 동물로부터 얻은 서로 다른 T 세포 하위 집단의 분석에 사용된 게이팅 도식을 보여줍니다. 림프구는 먼저 전방 산란광 FSC 대 측방 산란광 SSC를 통해 게이팅 되었으며, 이후 SSC 및 AQUA 음성 집단을 기반으로 살아있는 림프구를 식별하였습니다. 이어서 CD3 발현을 통해 T 세포를 식별하였으며, CD3 양성 T 세포 집단 내에서 CD4 양성, CD8 음성 및 CD4 음성, CD8 양성 집단 또한 결정하였습니다.

CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포는 CD28 및 CD95 발현을 기준으로 나이브 세포, 중앙 기억 세포 및 작동 기억 세포의 서로 다른 하위 집단으로 추가 구분되었습니다. 이 그림은 자극하지 않은 상태와 pma, CIN으로 자극한 CD4 양성 T 세포 및 그 하위 집단에서의 인터페론 감마와 IL-2 생성을 보여줍니다.

자극에 의해 유도된 뚜렷한 사이토카인 프로파일에 주목하십시오. 각 하위 집합에서 PBMC의 다중 유세포 분석을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.

이 절차를 수행할 때, 단색 보정 대조군과 형광 마이너스 원(fluorescent minus one) 대조군을 모두 설정하는 것이 중요합니다. 유세포 분석 데이터를 적절하게 분석하기 위해서는 이 두 가지 대조군이 모두 필요합니다. 보정 대조군 선택에 관한 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.

또한, 형광 표지 항체를 사용할 때는 빛 노출로부터 시료를 보호하기 위해 샘플을 가려주는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.