Haemagglutination 분석을 사용하여 혈청의 반응성 및 Titre를 결정

헤마글루티닌 분석법을 이용한 혈청의 반응성과 역가 측정. 응집 반응은 가용성 항체와 입자성 항원 사이에서 일어나는 반응입니다. 여기에는 세포나 운반 분자가 포함될 수 있습니다.

운반체 표면의 에피토프는 항체가 결합하여 운반체들을 서로 가교 결합하게 하며, 이는 항원 항체 복합체라고 불리는 복잡한 격자 구조의 형성으로 이어집니다. 혈구 응집은 항체가 입자성 항원 역할을 하는 적혈구에 결합하는 특수한 형태의 응집 반응입니다. 적혈구는 쉽게 구할 수 있을 뿐만 아니라 그 결과를 육안으로 쉽게 확인할 수 있어 유용한 표적이 됩니다.

혈청 샘플을 단계별로 희석한 후 96-웰 U-바닥 플레이트에 넣습니다. 그 다음 적혈구 현탁액을 첨가합니다. 고농도로 존재하는 항체가 적혈구와 결합하면 거대한 격자 구조가 형성됩니다.

이 격자가 중력에 의해 가라앉으면서 ubo 플레이트의 모양에 맞게 형성됩니다. 위에서 보았을 때, 적혈구가 넓은 층을 이루고 있는 것이 관찰됩니다. 이는 헤마글루티닌 반응 양성을 의미합니다.

항체 수준이 낮으면 격자가 형성되지 않으며, 적혈구가 UBO 플레이트의 모양에 따라 바닥에 모여 작은 펠렛을 형성합니다. 이는 음성 혈구 응집 반응입니다. 이 도식은 양성 반응을 보여줍니다.

세포들이 가라앉으면서 격자를 형성하며, U자형 바닥 플레이트의 모양에 맞춰 배열됩니다. 왼쪽과 오른쪽에 보이는 평면도에서는 적혈구가 넓은 층을 이루고 있는 것을 볼 수 있습니다. 중간 정도의 항체가 존재할 경우, 일부 글자 형태의 응집이 관찰될 것입니다.

혈구 응집 반응을 통해 기지의 항원에 대한 서로 다른 혈청 시료의 반응성을 테스트할 수 있습니다. 또한 혈청 시료의 역가(titer)를 결정할 수 있으며, 역가는 양성 반응이 관찰된 마지막 희석 배수를 의미합니다.

일반적으로 혈청 샘플 내의 항체 농도가 높을수록 타이터(titer)가 높습니다. 이 도식은 음성 혈구 응집 반응을 보여줍니다. 적혈구를 가교 결합시키기에 항체의 양이 불충분한 상태입니다.

세포가 중력에 의해 가라앉으면서 웰의 측면을 따라 내려가 바닥에 단단한 펠릿을 형성합니다. 오른쪽 도표는 위에서 본 적혈구의 모습입니다. 이 실험을 위해서는 1개의 96-웰 U-바닥 플레이트가 필요합니다.

평평한 바닥의 플레이트를 사용하면 세포가 펠렛 형태로 침전되지 않아 결과 해석이 불가능하므로, 반드시 U자형 바닥 플레이트를 사용해야 합니다. 각 행의 웰에 50 µL의 테스트 혈청, 1% Riva 세포 현탁액, 그리고 1배 농도의 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 분주할 수 있는 피펫을 사용하십시오. 1번부터 12번까지, 50 µL의 PBS를 분주하십시오.

이것을 희석액으로 사용합니다. 이제 A1 웰에 혈청 50 µL를 넣으십시오. 이것이 첫 번째 2배 희석액입니다.

perpet을 사용하여 혈청 샘플이 충분히 혼합되었는지 확인하십시오. 혼합이 완료되면 well A1에서 50 µL를 취하여 well A2로 옮깁니다. 이것이 두 번째 1:2 희석 단계이며, 결과적으로 4배 희석이 됩니다.

3번부터 11번 웰까지 사용하여 이 희석 시리즈를 계속 진행하십시오. 12번 웰은 royal buffer saline 음성 대조군으로 사용되므로 혈청을 넣지 마십시오. 이제 충분히 혼합된 1% Riva 세포 현탁액을 취해, A1번 웰부터 A12번 웰까지 50 µL씩 옮기십시오.

세포를 첨가한 후, 플레이트를 덮고 가볍게 두드려 샘플과 세포가 잘 섞이도록 합니다. 그다음 37°C에서 60분 동안 배양합니다. 이때 습도가 유지되는 배양기를 사용하는 것이 적절합니다.

60분 동안의 배양 기간 동안 항원-항체 상호작용이 일어나며 세포가 가라앉기 시작합니다. 시청하고 계신 영상은 60분 전체 기간을 촬영한 타임랩스 사진입니다. 이 화면은 5번부터 10번 웰(well)을 확대한 모습입니다.

우리는 이미 이 실험에서 VBS 대조군이었던 12번 웰을 확인했습니다. 세포들이 단단한 펠렛(pellet)을 형성한 것으로 보아 분석이 적절하게 수행되었음을 알 수 있습니다. 5번과 6번 웰은 양성 혈구 응집의 예시입니다.

7번 웰은 중간 응집 결과의 예이며, 8번, 9번, 10번 웰은 혈구 응집 반응에서 음성입니다. 이 결과에 따라, 양성 반응이 관찰된 마지막 웰인 7번 웰의 희석 배수를 기준으로 역가가 결정됩니다.