Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

본 논문에서는 갓 분리한 인간 기관지 분절로부터 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 확장시키는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 코딩 및 스크래칭, 100mm 배양 플레이트, 기관지 조직 복구, 기관지 조직 이식편의 전개, 섬모가 발달하며 성장하는 인간 기관지 상피 세포의 계대 배양, 트랜스웰(transwell) 상의 인간 기관지 상피 세포의 다섯 가지 섹션으로 구성됩니다. 시작하기 전에, 모든 단계는 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에서 수행되어야 함에 유의하십시오.

별도로 명시되지 않는 한, 재료, 시약 및 준비 섹션을 읽고 기본 준비가 되었는지 확인하십시오. 다음의 코팅, 스톡 솔루션 배양, 배지 해리 용액, 코팅 및 스크래치 작업은 100 mm 배양 플레이트에서 수행해야 합니다.

모든 과정을 무균 상태로 유지하십시오. 멸균된 100 mm 배양 접시와 코팅 용액을 준비합니다. BST 피펫을 사용하여 코팅 용액 2 mL를 100 mm 접시에 넣고, 접시 바닥이 코팅되도록 가볍게 흔들어 섞어줍니다.

코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮었는지 확인하십시오. 남은 용액을 피펫으로 옮겨 두 번째 100 mm 플레이트를 코팅하는 데 사용하십시오. 필요한 플레이트 수만큼 이 과정을 반복하십시오.

필요한 플레이트의 수는 조직 절편의 수에 따라 달라집니다. 코팅 용액이 플레이트 바닥을 고르게 덮었는지 확인하십시오. 시연된 바와 같습니다.

플레이트를 덮개로 덮습니다. 인큐베이터에서 1~2시간 동안 플레이트를 건조시킨 후, 기관지 조직 explant를 위해 사용하기 전 과잉 용액을 흡입하여 제거합니다. 사용하지 않은 코팅 배양 플레이트는 멸균 백에 넣어 4 °C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.

70% ethanol로 소독한 작고 날카로운 가위, 메스 및 핀셋을 사용하여 BSC 내의 플레이트에 긁힘(scratch) 코팅을 하며, 메스로 강하게 눌러 플레이트당 최소 4개의 깊고 작은 XS 모양의 흠집을 만듭니다. 긁힘이 충분히 깊지 않으면 조직 조각들이 고정되지 않고 떠오르게 됩니다. BSC 외부의 P3 디쉬에 조직을 넣습니다. 분리된 인간 기관지 조직을 BSS로 충분히 헹굽니다.

기관지 조각들을 개방합니다. 조직을 BS로 가져와 차가운 DM EM ham F 12 및 1% 항생제-항진균제(antibiotic anti mycotic)가 담긴 멸균된 100mm 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 작고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 2~3mm 크기의 정육면체 조각으로 절단합니다.

핀셋을 사용하여 절단된 조직 한 조각을 각 X의 중앙에 놓고 누릅니다. 조직 조각 또는 X 외식편이 플레이트에 몇 초 동안 부드럽게 부착되도록 둡니다. 그런 다음 완전 배지 10 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 배지를 첨가한 후 조직이 떠 있다면, 핀셋을 사용하여 조직을 X의 홈 안으로 밀어 넣거나 새로운 X를 만듭니다. 홈이 충분히 깊지 않은 경우 새로운 X를 만들어야 할 수도 있습니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣고 조직을 이식할 준비가 될 때까지 3~4일마다 배지를 교체합니다. 상피 세포가 조직 주변으로 1~2cm 영역을 덮을 만큼 충분히 성장할 때까지 약 4주가 소요됩니다. 100mm 코팅 및 스크래치 플레이트를 사용하십시오.

일부 조직 외식편의 배양이 성공하지 못할 수 있으므로, 플레이트의 수는 이식하려는 조직 조각의 수에 따라 결정됩니다. 이전에 코팅하여 4°C에서 보관한 플레이트를 사용하는 경우, 사용 전 실온으로 가져오십시오. 핀셋을 사용하여 원래 플레이트에서 조직을 조심스럽게 집어 새 플레이트의 축 중심에 놓고 가볍게 누릅니다. 성장이 없는 조직은 폐기해야 합니다.

조직이 플레이트에 부착되도록 둡니다. 몇 초 동안 배지를 추가하고 배양합니다. X 설명에 대해 앞서 기술한 내용을 추가하십시오.

각 100 mm 조직 배양 플레이트당 2 mL의 trypsin 및 EDTA 스톡 용액을 사용합니다. 스톡 용액을 6 mL의 멸균된 0.01 M PBS로 희석하며, 스톡 용액 2 mL를 PBS 6 mL에 혼합하여 최종 농도가 trypsin 250 µg/mL, EDTA 100 µg/mL가 되도록 합니다. 외식편(explants)을 새 플레이트로 옮긴 후, 1~2 cm 크기의 세포 링이 형성된 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

각 100 mm 플레이트에 따뜻하게 희석된 drips 및 edt 용액 8 mL를 추가합니다. 그리고 37 °C 인큐베이터에 3~15분 동안 넣어둡니다. 자주 확인하십시오.

트립신을 너무 오래 처리하면 세포가 손상될 수 있습니다. 현미경으로 플레이트를 확인하여 대부분의 세포가 떨어졌는지 확인하십시오. 8배율 확대 영상에서 보는 바와 같이 세포는 둥글게 변하며 떨어져 나갑니다. EDTA 용액을 불활성화하기 위해 플레이트당 10% FBS가 포함된 배지를 첨가하십시오.

모든 플레이트의 부피를 하나의 튜브에 합치거나 조직별로 서로 다른 튜브에 나눕니다. Hema Cytometer를 사용하여 세포 수를 측정하고, 100 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 세포 펠렛이 형성되면, 이를 완전 배지에 재부유시켜 원하는 세포 농도로 맞춥니다.

T 75 플라스크당 200만 내지 300만 개의 세포를 분주하고 필요한 만큼 완전 배지를 첨가합니다. 배양하며 배지를 교체합니다. 3~4주마다 세포가 T 75 플라스크 내에서 sub confluence 상태로 성장합니다.

약 4주 후에 세포를 떼어내어 확장하거나, 노화를 방지하기 위해 sub confluence 상태에서 사용해야 합니다. 먼저 transwell의 투과성 막을 준비하십시오. 24-well 멀티웰 플레이트에 맞는 6.5 millimeter 인서트를 사용하십시오.

멤브레인 양면에 배지를 추가합니다. 바닥면에는 6 mils, 윗면에는 0.1 mils를 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.

막의 양쪽에서 배지를 조심스럽게 제거하십시오. 기저부 부피부터 시작하여 조심스럽게 제거해야 하는데, 이는 막이 쉽게 손상될 수 있기 때문입니다. 따라서 배지 권장량을 사용하여 배양 인서트의 측면을 따라 배지를 파이펫으로 흡입하십시오.

그렇게 하지 않으면 배지가 세포를 접종할 다른 웰로 넘쳐흐를 수 있습니다. 투과성 지지체를 사전 배양한 후, 6.5 millimeter 웰의 막 상단(apical side)에 0.1 mL의 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 접종합니다. 막 하단(basal side)에는 0.6 mL의 배지를 피펫팅합니다.

10일 동안 세포의 정단면(epical side)과 기저면(basal side) 모두에 배지를 공급하십시오. 잘 분화된 배양 상태를 확립하기 위해 일주일에 두 번 배지를 교체하십시오. 시연된 방법을 사용하여 기저면의 배지 볼륨을 제거하십시오.

먼저, 상단 배지를 교체하고 멤브레인의 기저측에 0.6 mL의 배지를 추가합니다. 이 방법은 세포의 멤브레인 부착을 촉진하고 세포가 장시간 공기에 노출되는 것을 방지합니다. 배지를 빠르게 교체한 후 인큐베이터에 다시 넣습니다.

10일째에 AAL 배지를 제거하고 멤브레인의 기저측 배지를 0.6 mL로 교체하여 공기-액체 계면(air liquid interface)을 형성합니다. 6주 동안 공기-액체 계면 상태로 세포를 배양하며, 배지는 일주일에 두 번 교체합니다. 공기-액체 계면 형성 4주 후부터 섬모 세포가 나타나기 시작합니다.

액체 계면. 세포들은 섬모 세포로 균일하게 분화될 것입니다. 귀 액체 계면 형성 6주 후의 모습입니다.

적출물 및 이식물에서 유래한 건강한 상피 세포가 포함된 인간 기관지 분절입니다. 본 연구에서는 기관지 조직 적출물로부터의 배양이 9개 조직 중 8개에서 성공적으로 이루어졌습니다. 적출물 배양물 중 하나가 감염된 것을 제외하고, 상피 세포 링은 3~4주 만에 반지름 1~2cm에 도달했습니다.

성공적인 X explant는 최대 6회까지 다시 배양되었습니다. 모든 성공적인 배양물은 이식 시작 후 48시간 이내에 세포 이동의 증거를 보이거나, B 세포에서 보여지는 것처럼 이러한 상피 세포의 특징인 자갈 모양(cobblestone appearance)의 X explant를 나타냈습니다. 이후의 그림들에서, explant 유래 세포와 커버슬립에 파종된 세포의 사이토신 준비물에 대한 면역 염색 결과, 모든 세포가 상피 특이적 cytokeratin에 양성 반응을 보였으며, 여기에는 T 75 플라스크에서 sub confluence 상태까지 성장한 인간 하위 배양 기관지 세포가 표시되어 있습니다. 자갈 모양의 외형에 유의하십시오.

인간 기관지 세포의 계대 배양물은 keratin과 E.Cadherin에 대해 균일한 양성 면역염색을 나타냈습니다. 다른 세포 유형에 대한 특이 항체를 이용한 면역염색에서는 섬유아세포, 중간엽 세포 또는 내피세포에 의한 배양물 오염 징후가 나타나지 않았습니다. 자세한 내용은 본문의 그림 5와 해당 범례를 참조하십시오. 투과성 폴리에스테르 막 또는 트랜스웰(transwells)에서 배양된 세포는 액체-기체 계면(liquid interface)을 통해 여기서 입증된 바와 같이 섬모 상피로 분화되었습니다. 여기서 입증된 것과 다른 형태의 세포가 나타나기 시작하면 세포와 그 이식물을 폐기하십시오. 본 프로토콜에서는 일차 인간 기관지 상피 세포의 배양 및 증식을 위한 상세한 방법을 제시하였습니다.

인간 폐 질환 메커니즘의 중요한 경로를 결정하고, 새로운 약물의 독성 및 약리학적 스크리닝을 수행하기 위해서는 인간 세포 기반 연구가 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 방법이 여러분이 절제 조직으로부터 인간 기관지 상피 세포를 배양하고, 이를 연구 시스템에 활용하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 감사합니다. 행운을 빕니다.