식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

식물 세포벽의 매트릭스 다당류 조성과 결정질 셀룰로오스 함량을 결정하는 과정은 건조된 식물 시료에서 시작하며, 이를 다양한 추출 공정에 처리합니다. 그 결과로 얻은 물질은 세포벽으로만 구성되며, 이후 매트릭스 다당류 조성을 결정하기 위해 분할됩니다. 세포벽 물질을 약산으로 처리하여 주로 헤미셀룰로오스인 비결정질 다당류를 단당류로 가수분해합니다.

그 다음 단당류를 이에 대응하는 휘발성 알돌 아세테이트(aldol acetates)로 유도체화하며, 결정성 셀룰로오스를 정량하기 위해 질량 분석계와 결합된 가스 크로마토그래피로 이를 분석하고 정량합니다. 세포벽 성분은 비결정성 벽 성분을 제거하는 산 혼합물인 그래프 시약(graph reagent)으로 처리합니다. 남아있는 결정성 셀룰로오스는 단량체인 포도당으로 분해되며, 이는 화학량론적으로 분석할 수 있습니다.

리그닌 함량 및 조성의 결정 방법은 또 다른 JoVE 비디오 출판물인 '식물 세포벽의 종합적인 조성 분석, 파트 1 리그닌(Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin)'에서 설명하고 있습니다. 안녕하세요, 저는 미시간 주립대학교 그레이트 레이크스 바이오에너지 연구 센터의 세포벽 분석 시설 책임자인 Marcus Pauley입니다. 저는 세포벽 분석 시설 매니저인 Cliff Foster입니다.

오늘은 다양한 호모셀룰로오스(Homo celluloses) 내의 셀룰로오스인 식물 세포벽 물질에 존재하는 다당류의 조성을 결정하는 방법을 보여드리겠습니다. 이곳 그레이트 레이크스 바이오에너지 연구 센터(Great Lakes Bioenergy Research Center)에서는 이러한 당류를 바이오 연료로 전환하는 기술을 개발하고 있습니다. 최적의 식물 원료를 식별하기 위해서는 먼저 이 바이오매스에 존재하는 당의 종류와 양을 평가해야 합니다.

식물 세포벽의 종합적 성분 분석, 제1부 리그닌이라는 제목의 다른 영상에서는 폴리페놀 분석에 집중해 보겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 세포벽을 분리하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.

약 60~70 mg의 건조 식물 재료를 2 ml SAR TED 스크류 캡 튜브에 넣고 5.5 mm 스테인리스 스틸 볼을 사용하여 분쇄합니다. 고처리량 대안으로 REM 밀을 사용하는 경우, 파트 1에서 설명한 eyewall이라는 분쇄 및 분주 로봇을 사용하십시오. 분쇄가 완료되면 스틸 볼을 제거합니다.

파트 1에서 보여준 방식과 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 세포벽을 계속해서 분리하고 잔류 전분을 제거하십시오. DS 전분 세포벽 물질 2 mg을 2 mL 원심분리 튜브에 정밀하게 측정하여 넣습니다. 이 작업을 고효율로 수행하는 방법으로는 eyewall 로봇을 사용할 수 있습니다.

로봇이 분쇄된 식물 시료가 담긴 튜브를 집어 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 구멍이 뚫린 튜브를 VI 피더 위에 놓습니다. 빈 튜브를 저울 위에 올린 후 진동을 통해 VI 피더 아래로 이동시키면, 위쪽 튜브의 구멍을 통해 시료가 아래쪽 빈 튜브로 스며들어 원하는 양의 시료가 모일 때까지 계속됩니다.

내부 표준물질로 acetol 100 micrograms를 첨가합니다. 아세톤으로 튜브 벽면을 헹궈 세포벽 물질을 튜브 바닥으로 모은 다음, 공기 흐름 하에서 아세톤을 매우 조심스럽게 증발시킵니다. 이어서 약산 가수분해를 수행합니다.

각 샘플에 2 M trichloroacetic acid 또는 TFA 250 µL를 조심스럽게 첨가하되, 시약이 튜브 벽면에 튀지 않도록 주의하십시오. 튜브 캡을 단단히 닫고 가열 블록에서 121 °C로 90분 동안 배양합니다. 그 후 가열 블록과 샘플을 얼음 위에서 냉각시킨 다음, 튜브를 10,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리하십시오.

매트릭스 다당류의 가용화된 당이 포함된 산성 상층액 100 µL를 펠렛 물질이 섞이지 않도록 주의하며 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 펠렛은 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 있습니다. 증발 장치 내의 유리 튜브에서 완만한 공기 흐름 하에 TFA를 증발시킵니다.

과량의 산을 제거하기 위해 2-프로판올 300 µL를 첨가하고, 볼텍싱 후 25 °C에서 증발시킵니다. 이 과정을 총 3회 반복합니다. 가스 크로마토그래피를 통해 단당류를 식별할 수 있도록 알돌 아세테이트 유도체화를 수행합니다.

먼저 단당류를 해당 개환 알돌(open ring aldols)로 환원시킨 후 아세틸화합니다. 자세한 지침은 함께 제공된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 절차의 각 단계는 이전에 제시된 프로토콜에 따라 시약 첨가, 배양, 공기 흐름 하에서의 증발, 그리고 다양한 세척 단계를 통한 과량의 시약 제거 순으로 진행됩니다.

마지막 단계에서는 알돌 아세테이트(aldol acetates)를 추출합니다. 먼저, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 500 µL를 넣고 가볍게 흔들어 섞습니다. 그런 다음 물 2 mL를 넣고 튜브 뚜껑을 닫은 뒤 볼텍싱(vortex)합니다. 튜브를 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 알돌 아세테이트가 포함된 에틸 아세테이트 층이 위로 가고 물 층이 아래로 가는 명확한 층 분리를 유도합니다. 에틸 아세테이트 층에서 50 µL를 취해 인서트(insert)가 있는 GC-MS 바이알에 옮깁니다. GC 바이알에 아세톤 100 µL를 넣어 희석하며, 해당 GC 바이알은 4 °C에서 보관할 수 있습니다.

GCMS 분석을 즉시 진행하지 않을 경우, 쿼드러플 질량 분석기가 장착된 가스 크로마토그래프에 시료를 주입하십시오. 컬럼 및 분석 세부 사항은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 결정성 셀룰로오스 함량을 결정하기 위한 출발 물질은 분리된 세포벽 물질 또는 약산인 TFA로 이미 처리된 벽 물질이며, 산 처리 직후의 상태이거나 보관 가능한 건조 형태일 수 있습니다.

이전에 설명한 대로 이소프로판올로 과잉의 TFA를 제거한 후, 두 개의 M sars 튜브에 있는 TFA 펠렛에 아세트산, 질산 및 물로 구성된 1 M Updegraff 시약을 8:1에서 2:1의 부피비로 추가합니다. 튜브 뚜껑을 단단히 닫고 볼텍싱한 후, 가열 블록에서 100 °C로 30분 동안 가열합니다. 이 처리를 통해 펠렛에는 결정성 셀룰로오스만 남게 됩니다.

그 외 모든 다당류는 가수분해 후, 얼음 위에 놓인 블록에서 시료를 실온 또는 그 이하의 온도로 냉각합니다. 그런 다음 시료를 10,000 RPM에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 펠렛이 흐트러지지 않고 펠렛의 물질이 제거되지 않도록 주의하며 상층액을 버립니다. 이를 위해 튜브에 약 150 microliters의 상층액을 남겨두고, 물로 펠렛을 여러 번 세척합니다.

다음으로, 결정과 셀룰로오스 펠렛을 글루코스로 완전히 가수분해하기 위해 고농도 황산으로 가수분해를 수행합니다. 먼저 sarta tube에 72% 황산 175 µL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 초기 배양 후, 시료를 볼텍싱하고 15분 더 배양합니다.

그 다음 물 825 µL를 추가하고 볼텍싱한 후, 샘플을 10,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액에 포도당이 포함되어 있는 동안, 주로 리그닌으로 구성된 갈색의 가용성 물질이 튜브에 일부 남아 있을 수 있습니다. 상층액의 포도당 함량은 비색 anthrone 분석법을 사용하여 측정합니다.

본 분석은 96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 수행합니다. 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 포도당 표준 곡선을 2회 반복 측정하여 작성하십시오. 각 샘플 상층액 10 µL와 물 90 µL를 표준 물질과 동일한 마이크로타이터 플레이트의 별개 웰에 혼합하여 샘플을 준비하고, 마지막으로 갓 조제한 시약 200 µL를 첨가하여 마무리합니다.

다음으로, 알루미늄 열 분산기가 있는 오븐에서 80 °C로 30분 동안 플레이트를 가열합니다. 가열이 완료되면 포도당 함유 시료가 노란색에서 청록색으로 변하는 것을 확인하십시오. 플레이트를 실온까지 식힌 후 충분히 흔들어 줍니다.

마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 625 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 셀룰로오스의 구성 단위인 glucose의 함량은 동일한 플레이트에서 작성된 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산합니다. 다음은 포플러 나무 조각의 다당류 분석에 대한 대표적인 결과입니다.

가스 크로마토그램 피크는 질량 프로파일 및/또는 표준물질의 머무름 시간으로 식별합니다. 단당류는 표준 곡선을 기반으로 정량화합니다. 매트릭스 다당류의 당 분석 결과, 헤미셀룰로오스를 나타내는 xylose가 높은 함량으로 나타났으나 다른 당들도 함께 존재합니다.

분석 결과에 따르면, 포플러 재료의 40%가 결정질 및 셀룰로스로 구성되어 있습니다. 이러한 함량과 조성은 식물마다 또는 서로 다른 식물 해부학적 구조 사이에 차이가 있을 수 있음에 유의하시기 바랍니다. 지금까지 폴리페놀 리그닌 분석을 위해 리그노셀룰로스 바이오매스의 다당류 함량 결정 및 조성 분석 방법을 보여드렸습니다.

1부를 시청해 주세요. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.