버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

본 프로토콜은 단백질 발현을 조절할 수 있는 조절 가능 프로토콜 촉진제(regulatable promoter)를 활용합니다. 본 실험에서는 메티오닌 억제성 촉진제(methionine repressible promoter)로부터 N two 도메인을 발현하는 고복제(high copy) 2마이크론 플라스미드를 사용합니다. 야생형 효모 세포에 이를 형질전환합니다.

플라스미드와 형질전환체는 uol이 결핍된 플레이트에서 선택합니다. 선택 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 코르티솔 매개 성장 정지를 통해 세포를 동기화합니다.

마지막으로, 시계열 실험 동안 메티오닌이 결핍된 배지로 세포를 옮겨 발현을 유도합니다. 단백질 농도는 웨스턴 블로팅으로 모니터링하고, 형태학적 표현형의 발현은 현미경으로 관찰합니다. 안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 생물과학과의 Claudia입니다.

저는 AL 연구소의 Bari Muji입니다. 오늘은 단백질 농도에 따른 형태학적 표현형 발달 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 세포 내 섭취 어댑터 단백질인 absent two의 N2 도메인이 과발현되었을 때 관찰되는 세포 분열 표현형의 형태학적 및 분자적 측면을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 이 프로토콜은 관심 단백질을 발현할 효모 균주를 구축하는 것으로 시작합니다. 본 실험에서는 메티오닌 억제성 프로모터인 MET25의 제어를 받는 Nth2를 포함하는 고복제 플라스미드 DNA를 야생형 효모 균주 W303에 형질전환하였습니다. 2 mM 메티오닌은 MET25 프로모터 활성을 억제합니다.

메티오닌이 없는 배지가 최대 발현을 가능하게 하지만, 최근 형질전환된 세포가 포함된 플레이트에서 6개의 콜로니를 선택하여 0.2 millimolar 메티오닌이 포함된 50 milliliters의 선택 배지가 담긴 삼각 플라스크에 접종하고, 다음 날 아침까지 30 degrees Celsius에서 200 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오. 600 nanometers에서 배양액의 광학 밀도를 측정하여 세포 밀도를 추정하십시오. 20 OD 600 nanometers per milliliter에 해당하는 세포를 멸균된 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 수확하십시오.

세포 주기를 동기화하기 위해 YPD 배지에서 세포를 볼텍싱하여 재부유시키고, DMSO에 녹인 1 mg/mL 스톡 용액을 사용하여 최종 농도가 15 µg/mL가 되도록 조절합니다. 30 °C에서 200 RPM으로 흔들어주며 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 유사분열 단계에서 정지된 세포의 비율을 확인합니다.

현미경으로 관찰하여 크기가 동일한 출아 세포의 수를 측정함으로써 다음 단계로 진행합니다. 세포 주기 정지 비율이 90% 이상인 경우에만, 2200 RPM에서 5분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 얼음처럼 차가운 물로 세 번 세척한 후, 메티오닌이 결핍된 선택 배지에서 세포 밀도가 약 0.5 OD 600 nanometers/mL가 되도록 펠릿을 재현탁합니다.

세포 부피의 절반을 새로운 멸균 튜브로 옮기고, methionine의 최종 농도가 0.2 millimolar가 되도록 첨가합니다. 이는 단백질 발현의 기저 수준으로 인한 효과를 확인하기 위한 대조군으로 사용됩니다. 두 배양액을 모두 30 degree Celsius 인큐베이터에 다시 넣습니다.

각 시간대별로 6시간 동안 매시간 세포의 표현형 발달을 분석합니다. 각 배양액에서 1 mL의 세포 현탁액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 70 µL의 배지에 재현탁합니다. 그다음 멸균수에 1 mg/mL 농도로 조제된 메틸렌 블루 스톡 용액 30 µL를 첨가합니다.

다음으로, 이 현탁액 약 6 µL를 깨끗한 유리 슬라이드 위에 피펫으로 분주하고 그 위에 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립을 살짝 눌러 유리 계면 사이에 세포가 얇고 균일한 층을 형성하도록 합니다. 커버슬립 영역을 9개의 구역으로 나누고 구역당 3장의 이미지를 촬영합니다.

정확한 정량을 위해 시야당 세포 수는 30개 이하여야 합니다. 연구 대상인 표현형을 보이는 세포의 수를 측정하십시오. 본 예시에서는 서로 분리되지 않고 신장되었거나 연결된 출아를 가진 출아 효모 세포가 이에 해당합니다. 또한 nth에 의해 유도된 세포 분열 결함으로 인해 파란색으로 식별되는 사멸 세포의 수도 함께 측정합니다.

두 가지 과발현은 매 시간마다 표현형 특이적 결함을 시각화하기 위해 세포 사멸을 유도합니다. 멸균된 마이크로 원심분리관에 배양액 1 mL를 취하고, 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 멸균수에 녹인 1 mg/mL의 Crystal Violet 용액 100 µL에 현탁하고, 상온의 암소에서 5분 동안 배양합니다.

Calcior white 염색을 통해 e 세포벽을 시각화할 수 있습니다. 펠릿을 1x PBS로 3회 세척합니다. 최종 펠릿을 100 µL의 PBS에 현탁합니다.

현미경으로 세포를 관찰하고, UV 광학계를 사용하여 세포벽을 시각화하며 100 x 배율로 이미지를 획득합니다. GFP가 태그된 septin을 시각화하려면 FS E 필터를 사용하여 이미지를 획득하십시오. 커버슬립을 9개의 구역으로 나누고 구역당 3장의 이미지를 촬영하여 세포 수를 세는 앞서 설명한 방법을 통해, 세포벽 결함 및 septin 오배치(mis localization)가 나타난 세포의 백분율을 정량화하고 타임랩스(TimeLapse) 비디오를 촬영합니다. 단일 효모 세포의 현미경 관찰에는 배지가 포함된 agar bed가 필요하므로, agar bed를 제작합니다.

먼저 오목한 홈이 있는 유리 슬라이드를 70% alcohol로 세척하고 자연 건조시킵니다. 슬라이드가 건조되는 동안, methionine이 결핍된 선택 배지 5 mL에 agros 0.06 g을 넣고 agros가 빠르게 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열합니다. agros가 포함된 배지 200 µL를 피펫으로 취해 슬라이드에 분주합니다.

오목 슬라이드 위에 깨끗한 다른 유리 슬라이드를 뒤집어 덮고, 아래쪽에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 겔이 응고되면, 두 슬라이드의 표면이 항상 평행을 유지하도록 하면서 상단 슬라이드를 오목 슬라이드로부터 부드럽게 밀어 이동시킵니다. 이렇게 하면 아가로스 층의 표면이 오목 슬라이드의 표면과 동일한 평면이 됩니다.

부드러운 티슈를 사용하여 agros bed 주변의 슬라이드 영역을 닦아냅니다. 이제 슬라이드는 4시간 후에 사용할 준비가 되었습니다. 배양액에서 1 mL의 세포를 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 회수합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고 메티오닌이 포함되지 않은 신선한 선택 배지 100 µL에 세포를 재부유시킵니다. 커버 슬립의 가장자리에 바세린을 바릅니다. 그다음 세포 현탁액 한 방울을 agros bed 중앙에 떨어뜨리고, 그 위에 커버 슬립을 살짝 눌러 균일하게 펴줍니다.

커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 매니큐어를 발라 위치를 고정합니다. 매니큐어가 마르면 슬라이드를 현미경의 가열 스테이지 위에 놓습니다. 시간이 지남에 따라 시야가 붐비게 되므로, Zeiss Axio camm, MRM 단색 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axio 200 M 현미경을 사용하여 적절한 간격으로 10개 이하의 세포가 포함된 시야를 선택합니다.

세포가 분열하는 동안, 약 5시간 동안 5분마다 시야의 이미지를 촬영합니다. 초점을 반복적으로 재조정하는 것을 피하기 위해, 이미지 획득 소프트웨어를 프로그래밍하여 각 시점마다 몇 장의 Z-stack 이미지를 자동으로 획득하도록 설정합니다.

나중에 초점이 가장 잘 맞은 이미지를 선택하여 동영상을 제작합니다. 세포에 충분한 열을 공급하기 위해, 가열 스테이지 외에도 이미징이 진행되는 전체 시간 동안 현미경의 투과 백색광을 켜두어 외부 열원을 추가로 제공합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 이미지들을 동영상으로 합성함으로써 표현형 퇴행을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 관심 단백질을 과발현시킨 대표적인 결과를 보여줍니다. Nth two.

먼저, nth two의 단백질 발현을 확인하였습니다. 실험 시간 경과에 따라 HA nth two를 발현하는 세포의 용해물을 단일클론 anti HA 항체를 이용한 western blotting으로 분석하였으며, 면역 블롯 결과에서 보는 바와 같이 0.2 mM methionine 존재 하에 배양된 세포는 단백질 발현이 최소 수준이었습니다. 그러나 methionine이 결핍된 배지에서 배양된 세포는 실험 시간 경과에 따라 S two의 농도가 지속적으로 증가함을 보여주었습니다.

낮은 nth 두 농도는 세포 분열 표현형을 유도하거나 세포 사멸만을 일으키기에 불충분하므로, 메티오닌 존재 하 또는 부재 하에서 6시간 동안 배양한 세포를 분석하였습니다. 메틸렌 블루로 염색한 후 파란색으로 나타나는 세포의 비율이 낮아, 사멸한 세포가 적음을 확인할 수 있었습니다. 마찬가지로, 세포당 핵의 수, 세포벽 및 septin 조직은 예상대로 정상적이었습니다.

이와 대조적으로, M2의 과발현은 심각한 세포 분열 결함과 세포 사멸을 유발하며, 이는 메틸렌 블루로 염색했을 때 푸른색을 유지하는 길게 연결된 신장된 출아들의 긴 사슬로 입증됩니다. DPI 염색 결과에서 나타나듯이, 대부분의 표현형 세포는 다핵성입니다. Calcofluor white 염색은 비정상적인 세포벽 패치의 축적을 보여줍니다.

또한, septin이 심하게 잘못 배치되고 무질서하게 나타납니다. 시간에 따른 표현형 정량화 결과가 이 그래프에 표시되어 있으며, 빈 원은 0 mM methionine을, 채워진 원은 0.2 mM methionine을 나타냅니다. 이를 통해 시간이 지남에 따라 세포 내에 nth two 농도가 축적되면서, 세포 분열 표현형을 보이는 세포의 비율 또한 증가하는 것을 확인할 수 있습니다.

0.2 mM methionine에서 배양된 대조군 세포는 표현형 발현이 세포 배양 조건 때문이 아니라 단백질 농도의 증가에 따른 결과임을 보여줍니다. 마지막으로, nth two 과발현에 따른 표현형 발현 과정이 타임랩스 비디오 현미경으로 촬영되었습니다.

nth 처리 4시간 후, 두 개의 과발현 세포에서 가벼운 형태학적 세포 분열 표현형이 나타납니다. 영상이 진행됨에 따라, 정단아(apical bud) 성장이 비정상적으로 연장되어 매우 길쭉한 아(bud)가 형성되는 것을 확인할 수 있습니다. 또한, 세포 분리 이벤트가 일어나기 전에 새로운 아가 출현하는 현상도 관찰됩니다.

또한, 모세포의 여러 영역에서 출아(bud)가 발생하는 것이 관찰되며, 이는 가지가 뻗어 나오는 모양으로 나타납니다. 지금까지 출아 효모에서 단백질 농도에 따른 형태학적 표현형의 발달을 특성화하고 분석하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 더 빠른 속도는 세포에 손상을 줄 수 있으므로 권장되는 원심분리 속도로 세포를 처리하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

methylene blue와 chloride는 light east 세포에 독성이 있으므로, 이미징 직전에 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.