의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

본 절차의 전반적인 목표는 배양 중에 조작된 난소 부위(OO sites)로부터 유래한 발달 중인 배아를 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 한 마리의 암컷으로부터 공여자 난소 부위를 분리하고 배양 상태에서 원하는 대로 조작합니다. 절차의 두 번째 단계는 프로게스테론을 사용하여 이 세포들의 성숙을 자극하고, 잠재적 수용자 암컷에게 생식샘자극호르몬을 주입하여 산란을 촉진하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 공여 세포를 생존 염색약으로 염색하고 호스트로 사용할 암컷을 준비하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 공여 세포를 호스트의 체강으로 외과적으로 이식하고, 몇 시간 후에 이식된 난자를 회수하여 수정시키는 것입니다. 최종적으로 실험적으로 조작된 공여자로부터 유래된 정상적으로 분열하는 배아를 얻게 됩니다.

Cytes는 일반 배아와 동일한 방식으로 얻고 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 아이오와 대학교의 Doug Houston입니다. 오늘은 Cold Spring Harbor Xap 코스에서 숙주 이식 절차를 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 모성 유전자 산물의 역할을 연구하고 초기 제브라피쉬 발달에서의 역할을 규명하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 수술을 시작하기 전, 수술 부위가 소독되었는지 확인하고 신선한 배지와 멸균된 도구가 준비되었는지 확인하십시오.

니들 홀더로 봉합 바늘을 원하는 방향으로 잡습니다. 마취된 암컷 개구리를 젖은 수술용 거즈 위에 등으로 눕힙니다. 작은 아이리스 가위를 사용하여 복부 하단, 정중선 외측의 피부를 1 cm 정도 절개합니다.

복근을 자르지 마십시오. 포셉을 사용하여 근육층과 주변의 흰색 근막을 들어 올립니다. 아이리스 가위를 사용하여 근육을 관통해 아래로 단번에 빠르게 절개하십시오.

절개 부위를 1cm까지 확장하여 난소를 노출시킵니다. 포셉을 사용하여 난소를 잡고 엽 하나를 끌어냅니다. 가위를 사용하여 체벽 높이에서 해당 엽을 잘라냅니다.

조직을 난모세포 배양 배지(oocyte culture medium 또는 OCM)가 담긴 90 mm 접시에 넣고, 해부 현미경 하에서 난소의 품질을 즉시 평가하십시오. 핀셋을 사용하여 난모세포 몇 개를 탈피시킬 수 있습니다. 난모세포가 단단하고 크기와 색상이 균일하다면, 개구리로부터 원하는 양의 난소 조직을 채취하여 OCM이 담긴 90 mm 페트리 접시에 넣으십시오.

절개 부위를 봉합합니다. 바늘을 절개창에서 외측으로 몇 mm 떨어진 지점에 삽입하며, 이때 근육과 근막을 모두 관통하도록 합니다. 포셉을 사용하여 바늘을 조절하되, 봉합사의 끝부분이 완전히 빠져나오지 않도록 주의하십시오.

단순 결절 봉합법(simple interrupted pattern of suturing)과 서전스 스퀘어 매듭(surgeons square knots)을 사용하여 상처를 봉합합니다. 구체적인 기술 방법은 동반 텍스트에 상세히 설명되어 있습니다. 피부 층에 대해서도 동일하게 봉합을 반복합니다.

암컷 개체를 탈이온수로 헹군 후 시원한 물이 담긴 회복 버킷에 넣습니다. 수술을 마친 직후, 가위로 난소를 세분화합니다. 각각의 엽을 절개하여 펼친 다음, 2 cm² 크기의 조각으로 자릅니다.

깨끗한 배지로 헹구고 포셉을 사용하십시오. 개별 세포를 분리하기 위해 5~6개의 조각을 새로운 90 mm OCM 디쉬로 옮깁니다. 먼저 조각 하나를 작은 배지 디쉬로 옮긴 후 해부 현미경으로 가져옵니다.

시계 제작용 핀셋을 사용하여 3~500개의 난모세포를 수동으로 분리합니다. 두 번째 핀셋으로 난모세포 주변의 결합 조직층을 잡아 고정합니다. 첫 번째 핀셋으로 난모세포에 인접한 난소를 잡습니다.

난모세포를 가볍게 당겨 난포층을 찢어 개방합니다. 조직으로부터 난모세포를 조심스럽게 분리해 냅니다. 난포가 제거된 난모세포는 가시적인 혈관이 없으며, 난포가 온전한 난모세포보다 더 흐물거리는 특성이 있습니다.

면 전구로 막은 화염 연마 피펫을 사용하여 100~150개의 난자를 8 mL의 OCM이 들어 있는 60 mm 배양 접시에 옮깁니다. 난자를 배양 접시에 담아 18 °C에서 보관하십시오. 이제 여러 프로토콜에 따라 antisense oligonucleotides 또는 mRNA를 원하는 대로 미세 주입한 후, 18 °C 인큐베이터 내의 OCM에서 배양할 수 있습니다.

분리 후 96시간 이내의 난자를 이식에 사용하며, 이식 전날 저녁에 준비합니다. 필요한 난자를 성숙시키기 위해 프로게스테론과 함께 배양하며, 난자가 포함된 배지에 1mM 프로게스테론 16 µL를 첨가하여 최종 농도가 2 µM가 되도록 합니다. 같은 날 저녁에 18 °C에서 10~12시간 동안 배양하고, 산란을 유도하기 위해 암컷 3~5마리에게 마리당 1000 units의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)을 주입합니다.

이식 당일 아침에 암컷을 실온 또는 18 °C에서 밤새 보관하십시오. 해부 현미경으로 배양된 난모세포가 성숙되었는지 확인하십시오. 생존 염색약을 넣고 10,000 ×g 이상의 속도로 5분간 원심 분리하십시오.

잔해물로 인한 배경 신호를 줄이기 위해, 각 실험군 난자에 적절한 생존 염색 시약 80 µL를 첨가합니다. 로커 위에서 상온으로 15분 동안 배양합니다. 염색된 난자들을 신선한 o cm가 담긴 90 mm 디쉬로 옮기고 가볍게 회전시켜 세척합니다.

세포를 옮기는 데 사용할 피펫을 제작합니다. 다이아몬드 펜슬을 사용하여 피펫의 테이퍼진 부분에서 약 2cm 아래 지점에 흠집을 낸 후 깨끗하게 절단합니다. 이렇게 하면 난모세포가 들어갈 수 있을 만큼 충분한 1.5mm 구경의 피펫이 만들어집니다.

팁의 끝이 막히지 않도록 주의하며 가장자리가 매끄러워질 때까지 연마하십시오. 난자 이식. 수술은 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다.

마취된 암컷 중 양질의 알을 낳는 개체에 이전과 동일하게 절개창을 냅니다. 이 절개창은 이식용 보어(bore)가 겨우 들어갈 정도의 최소 길이여야 합니다. 1 cm 미만으로 피펫팅합니다.

실험용 난자가 담긴 배양 접시를 흔들어 난자들을 접시 중앙으로 모읍니다. 준비된 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 난자를 흡입합니다. 개구리에게 전달되는 액체의 양을 최소화하기 위해 난자들이 피펫 끝부분에 가라앉도록 둡니다.

포셉을 사용하여 근육과 근막의 플랩(flap) 하나를 잡고 들어 올립니다. 피펫 팁을 절개 부위에 삽입하고 난모세포가 체강 내로 천천히 흘러 들어가게 합니다. 모든 난모세포가 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다.

난모세포가 절개 부위 밖으로 쏟아져 나오는 것을 방지하기 위해 근육층을 놓지 마십시오. 포셉을 사용하여 절개 부위의 양측을 잡고 서로 모아 난모세포가 체강 내로 가라앉게 합니다. 이전과 동일하게 근육 및 근막층의 봉합을 시작하며, 첫 번째 매듭을 묶을 때까지 위쪽으로 긴장을 유지하도록 주의하십시오.

피부를 봉합합니다. 개구리를 탈이온수로 헹구고 이전과 동일하게 회복하도록 둡니다. 개구리는 수술 후 2~3시간이 지나면 정상적으로 산란을 시작해야 합니다.

암컷이 산란을 멈출 때까지 30분마다 일반적인 압착법으로 알을 회수하여 수집 접시에 담습니다. 1XMMR에 신선하게 수집한 정자 현탁액 4mL를 첨가하고 상온에서 4분 동안 배양합니다. 상온의 용액으로 알을 충분히 채우고 헹굽니다.

활성화와 절단을 위해 XMMR을 실온에서 배양합니다. 젤리 코트를 제거하려면 어느 단계에서든 시스테인을 사용하십시오. 이후 전이된 배아를 색상에 따라 별도의 디쉬로 분류하여 일반 배아와 동일하게 배양할 수 있습니다.

일반적으로 이식된 난자의 3분의 2 이상이 수정 후 수분 이내에 활성화되어 동물극에서 강력한 피질 수축을 보입니다. 대부분의 실험에서 이식된 난자의 절반 이상이 정상적인 1회 난할을 거칩니다. 때때로 난할이 대조군인 호스트 난자에 비해 20분 정도 지연되는 경우가 있습니다.

이식된 배아의 30~60%가 정상적으로 포배기에 진입하며 신경 단계 이후까지 생존합니다. 이식된 배아는 발달 과정의 여러 날 동안 생체 염색 색상을 유지합니다. 주입되지 않은 대조군 난자에서 유래한 배아는 예상대로 정상적으로 보일 것입니다.

이와 대조적으로, 예를 들어 beta catenin과 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligos)를 주입한 난자에서 유래된 배아는 중심 집중적인 형태를 띠게 됩니다. 지금까지 배양 상태에서 조작된 난자로부터 배아를 얻는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때는 건강하게 완전히 성장한 공여자 난자로 시작하고, 고품질의 난자를 가진 수용 female을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 이 방법의 성공률은 난자 분리 및 수술 수행 속도와 상관관계가 있는 경향이 있습니다. 따라서 일관된 결과를 얻기까지는 어느 정도의 연습이 필요할 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.