레이저 Microdissection는 세포의 하위 집합 유전자 발현 프로 파일링에 적용 Drosophila 윙 디스크

본 영상에서는 초파리 날개 성숙판(wing disc)의 유전자 억제 영역과 비억제 영역 간의 RNA 전사체 프로파일링 비교 분석을 위해 적용된 레이저 미세절단법(laser microdissection)에 대해 상세히 설명합니다. 이 방법의 생물학적 시료로는 수작업으로 분리한 초파리 상상판(image discs)이 필요하며, 주요 장비로는 레이저 미세절단기가 사용됩니다. 본 실험에서는 LI A-L-L-M-D 6, 000과 실시간 PCR 기기를 사용합니다.

BioRad iq를 사용하였습니다. 필요한 다섯 가지 소형 도구는 오목 플레이트, 소형 페인트 브러시, 미세절제 포셉, 현수적 슬라이드, 주사바늘에 장착된 곤충 핀, PET 막이 있는 금속 프레임, 소형 플라스틱 튜브입니다. 이 방법은 다음 단계들로 구성됩니다.

첫 번째 단계는 GAL4-UAS 시스템을 이용하여 자손에서 국소적이고 특이적인 유전자 억제를 유도하기 위해 적절한 두 가지 oph 형질전환 라인을 교배하는 것입니다. 두 번째 단계는 해부 프레임을 처리하는 것입니다. 세 번째 단계는 레이저 미세 해부 장치를 설정하는 것입니다.

4단계에서는 유전자 교배로 얻은 유충 자손으로부터 날개 성충원반을 수동으로 수집합니다. 5단계에서는 GFP로 표지된 성충원반의 특정 영역에 대해 레이저 미세절단을 수행합니다. 6단계에서는 원반의 억제된 영역과 억제되지 않은 동등한 영역의 전사체 프로파일링을 통해, 표적 유전자의 억제로 인해 유발된 효과를 규명할 수 있습니다.

유전자 X라고 명명된 유전자의 생체 내(in vivo) 전사 프로파일링을 위해서는 미세 절제 영역으로부터 RNA를 추출하고, 수동 절제의 정확도를 제어하며, R-T-P-C-R을 통해 두 샘플의 GFP 발현을 평가하고, 실시간 R-T-P-C-R 또는 마이크로어레이 분석을 수행하여 두 샘플에서 억제된 유전자의 추정 표적 발현량을 정량화하는 과정이 필요합니다. 이제 각 단계에 대한 자세한 내용을 살펴보겠습니다.

첫 번째 단계인 유전적 교배입니다. 유전적 교배는 GAL4 UAS 형질전환 계통을 이용하며, 유충 자손에서 유전자가 억제된 성충원판을 얻는 데 중점을 둡니다. 다재다능한 GAL4 시스템을 통해 RNA 간섭에 의한 특이적이고 국소적인 유전자 억제를 유도할 수 있습니다.

한 계통은 특정 시간적 또는 공간적 패턴으로 GAL4를 발현하는 드라이버 트랜스진과 GAL4 발현 영역의 시각화를 가능하게 하는 UAS-GFP 리포터를 교배에 도입합니다. 두 번째 계통은 세포 내에서 발현되었을 때 유전자 X를 특이적으로 표적할 수 있는 헤어핀 침묵 RNA를 발현하는 UAS 응답자 트랜스진을 도입합니다.

이 RNA는 절단되어 소형 간섭 RNA를 생성하며, 이는 이 교배의 자손에서 선택된 X 유전자를 특이적으로 억제할 수 있습니다. UAS 억제 트랜스진은 GAL four 단백질을 발현하는 세포에서만 전사되므로, X 유전자의 공간적으로 제한된 억제를 유도합니다. 다양한 응용 분야 중에서, 본 연구에서는 posterior 구획에서 특이적 억제를 유도하는 Grailed GAL four 드라이버에 의해 억제된 날개 디스크의 RNA 전사체 프로파일링에 집중하였습니다.

침묵 영역은 U-A-S-G-F-P 트랜스진의 발현으로 표시됩니다. 후방 구획에서 GGFP의 발현과 유전자 x의 침묵이라는 두 가지 사건이 유도될 것입니다.

두 번째 단계는 RNA 활성을 억제하기 위해 해부 프레임을 처리하는 것입니다. 프레임 슬라이드와 해부 도구를 실온에서 최소 1시간 동안 DEPC water로 세척한 후, 멸균 챔버에서 건조합니다. RNA 활성을 억제하려면, RNA가 제거된 새 50 ml 튜브에 DEPC water를 채우고 핀셋, 행잉 드롭 슬라이드, 펫 프레임을 튜브 안에 넣으십시오.

두 가지 모두 미세해부에 필요합니다. 튜브를 닫고 거꾸로 뒤집은 다음, 최소 한 시간 동안 반응하도록 둡니다. 상온에서 한 시간이 지난 후, 핀셋을 사용하여 DEPC water를 다른 튜브로 옮깁니다.

슬라이드가 떨어지지 않도록 튜브 안에 고정합니다. 그런 다음 튜브 내부에서 슬라이드를 건조시킵니다. 3단계, 마이크로디섹션 설정 단계입니다.

먼저 형광 램프, 현미경, 미세절단 소프트웨어 등 필요한 모든 장치를 켭니다. 레이저 또한 켜라는 경고 창이 나타나면, 이를 수행하고 미세절단 설정을 마무리하는 동안 레이저를 예열하십시오.

이제 조직을 수집할 웰을 준비할 차례입니다. Leica LMD 6,000 레이저 컷팅 장비는 서로 다른 샘플을 수집하기 위해 최대 4개의 튜브를 장착할 수 있습니다. 본 실험에서는 2개의 튜브만 필요합니다.

하나는 GFP 양성 침묵 조직을 수집하고, 다른 하나는 마이크로 피펫을 사용하여 GFP 음성 비침묵 조직을 수집합니다. RNA를 보존하기 위해 두 튜브 캡 모두에 20 µL의 TRI reagent 용액을 채웁니다. 이제 마이크로분리 준비가 완료되었습니다. 4단계, JoVE 유충에서 날개 상상판의 수동 분리입니다.

앞서 설명한 방식대로 얻은 유충 자손으로부터 날개 원반을 분리하고, 다른 조직이 원반을 오염시키지 않도록 주의하십시오. 이 목적을 달성하기 위해, 해부 방법은 일반적으로 모든 원래 원반을 대량으로 수집할 때 사용하는 방법과는 상당히 다릅니다. 우선, 링거액으로 유충을 세척하여 부착된 배지를 제거하십시오. 그런 다음 유충을 행잉 드롭 슬라이드로 옮기고, 입 부분을 아래로 당기면서 즉시 머리를 절단하십시오.

이제 곤충 핀을 사용하여 다른 조직들을 조심스럽게 제거합니다. 빨간색 외곽선은 수집해야 할 성충 날개 원판(imaginal wing discs)을 나타냅니다. 조직이 달라붙지 않도록 신속하고 부드럽게 분리하십시오. 분리된 각 날개 원판을 즉시 절단하기 위해 해부 프레임으로 옮깁니다.

이 절차는 총 100개의 날개 원반(wing disc)이 확보될 때까지 반복해야 합니다. 5단계, GFP가 표지된 날개 원반의 특정 영역에 대한 레이저 미세 절단입니다. 원래의 날개 원반이 막 위에 고정되면 절단을 진행할 수 있습니다.

프레임을 홀더에 끼우고 홀더를 전동 스테이지에 고정합니다. LMD 6,000을 일반 현미경으로 사용하여 원래의 날개 원반(wing disc)을 찾습니다. 초점을 맞춘 후 절단 영역을 설정합니다.

디스크의 양측, 즉 GFP 양성 구역과 그 반대편 구역 모두를 포함하는 타원형 영역을 그립니다. GFP 양성 부분을 수집할 튜브 캡을 선택하십시오. Start cut 버튼을 누릅니다.

마이크로 절단기는 '이동 및 절단(move and cut)' 기능을 선택하여 이전에 설정한 속도와 출력으로 조직을 절단합니다. 선택되지 않은 조직 조각이 떨어져 나갈 때까지 수동으로 절단을 정밀하게 조정할 수 있습니다. 3D 애니메이션은 마이크로 절단기의 작동 원리를 보여주며, 레이저가 조직에 집중되어 선택된 둘레를 따라 절단하는 과정을 나타냅니다.

절단이 완료되면 조직 조각이 선택한 튜브 캡 안으로, 결과적으로 tri Reagent 속으로 떨어집니다. 첫 번째 절단 후, 날개 원반의 반대편으로 절단 부위를 이동하여 이에 상응하는 GFP 음성 영역을 절단하십시오. 새로운 절단을 진행하기 전, GFP 양성 조직과 GFP 음성 조직을 분리하여 보관할 수 있도록 반드시 다른 튜브 캡을 선택하십시오.

자동 절단 후 시작 절단 버튼을 누르십시오. 두 번째 절단 전, 3D 애니메이션에 표시된 대로 수동으로 절단 부위를 정밀하게 조정하십시오. 전동 스테이지가 선택된 튜브 캡을 절단 영역 아래로 이동시킵니다.

레이저 빔이 선택한 외곽선을 따라 조직에 집중되어 절단하며, 절단이 완료되면 조직 조각이 Tri 시약이 들어 있는 선택된 튜브 캡으로 떨어집니다. 충분한 양의 시료를 수집하기 위해, 성충 날개 원판(imaginal wing discs) 100개에 대해 이 과정을 반복했습니다. 샘플 수집이 완료되면 튜브를 꺼냅니다.

이 단계는 매우 정밀한 작업이 필요하며, 실수할 경우 지금까지 수행한 모든 작업을 잃게 될 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 캡을 거꾸로 닫은 후 실험을 계속 진행하십시오.

이것은 GFP 양성 조직이 있는 샘플입니다. 이것은 GFP 음성 조직이 있는 다른 샘플입니다. 6단계, 전사체 프로파일링입니다.

튜브를 원심 분리하여 캡에서 액체를 분리하고, Try 시약을 1 mL까지 첨가합니다. 약 5,000 µm² 크기의 구역 100곳에서 표준 Try 시약 프로토콜에 따라 RNA 추출을 수행합니다. RNA 수득량은 1.5 µg이었습니다.

우리는 random hexa를 사용하여 CD NA를 합성하기 위해 vitrogen의 superscript three를 사용했습니다. 수동 해부의 정확도는 R-T-P-C-R을 통해 두 시료의 GFP 발현을 확인함으로써 제어되었습니다. 이는 정량적 R-T-P-C-R 젤 이미지에 나타난 바와 같습니다.

당사는 유전자 X의 침묵 유전자 발현 수준을 해당 유전자 X 매개 조절 경로의 잠재적 표적들의 발현 수준과 함께 평가하였습니다. 이 도표는 유전자 X와 그 잠재적 표적 중 하나인 유전자 Y의 발현 수준 예시를 보여줍니다. 이는 분화되지 않은 날개 디스크의 전-후 구획에서의 기저 발현 수준을 기준으로 나타낸 것입니다.

선택된 유전자 X의 활성은 사이런싱(silencing) 시 40%로 감소한 것으로 나타났습니다. 이와 대조적으로, 추정 표적 중 하나인 유전자 Y는 7배의 유의미한 상향 조절이 확인되었으며, 이를 통해 유전자 Y가 유전자 X에 의해 음성적으로 조절된다는 가설을 검증할 수 있었습니다. 결론적으로, 위에서 설명한 실험적 접근 방식은 다양한 조절 경로 내 추정 표적의 검증에 성공적으로 적용될 수 있습니다.