2 차원 가보 필터 기반으로 광학 현미경 스캐터

본 영상에서는 광산란 현미경(optical scatter microscopy)을 사용하여 세포 사멸(apoptosis) 과정 중의 미토콘드리아 단편화를 정량화합니다. 본 프로토콜에서 광산란 현미경은 일반적으로 형광을 필요로 하지 않지만, 검증 목적으로 형광 이미지를 획득합니다. 이미징 시스템 설정을 마친 후, 세포를 MIT tracker green으로 라벨링하고 staurosporine을 처리하여 세포 사멸을 유도합니다.

2시간 이내에 세포 소기관의 배향 변화를 감지하기 위해 광학 데이터를 획득합니다. 미토콘드리아 파편화의 시작은 하위 세포 입자의 배향 정도가 감소하는 것을 보여주는 광학 산란 데이터를 통해 측정할 수 있습니다. 이후 광학 산란 데이터를 미토콘드리아를 포함하는 형광 영역과 상관 분석하여 데이터를 검증합니다.

안녕하세요, 럿거스 대학교 의생명공학과 Bio Optics 연구실의 Nada Bustani입니다. Bio Optics 연구실의 Rob Pak입니다. 그리고 저 역시 Bio Lab의 Deen입니다. 오늘은 형광 염료에 의존하지 않는 방법을 사용하여 세포 내 소기관의 형태학적 동역학을 정량화하는 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 세포 자살 또는 프로그램된 세포 사멸 동안의 세포 내 구조의 역동적인 변화를 연구하기 위해 이 기술을 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 70% ethanol로 장갑을 낀 손을 소독하며 이 절차를 시작하십시오.

그런 다음, 준비된 100 nM MitoTracker Green 스톡 용액과 미리 데워둔 BAEC 세포 배양 배지를 조명이 꺼진 후드 안에 두고 모든 표면을 멸균합니다. 다음으로, 커버 글라스 위에 세포가 플레이팅된 6-웰 배양 접시를 후드 안에 놓습니다. 진공 라인에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용합니다.

웰에서 세포 배지를 제거합니다. 그런 다음 세포의 미토콘드리아를 표지하기 위해 각 웰에 표지 배지 2 mL를 즉시 첨가합니다. 조직 배양 플레이트를 덮어 실내 빛에 직접 노출되는 것을 방지하고, 세포를 빠르게 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

세포를 37 °C에서 45분 동안 배양하십시오. 먼저 광학 설정을 준비하기 위해 수은 아크 램프를 켭니다. 그런 다음 컴퓨터, 현미경 카메라 및 레이저를 켜고, 스피닝 디퓨저(spinning diffuser)에 디지털 미세 거울 소자(DMD)를 연결하십시오.

다음으로, 현미경 접안렌즈를 통해 광학 런칭(optical launch)이 정렬되었는지 확인하십시오. 시야가 레이저 빛으로 밝게 조명되어야 합니다. 샘플을 로드하려면, 63 x 오일 침강 대물렌즈가 완전히 내려간 상태에서 렌즈 위에 침강유를 한두 방울 떨어뜨리십시오.

그 다음, 10 µm 간격의 격자선으로 구성된 gradi 슬라이드를 스테이지에 장착하고, 대물렌즈를 올려 오일로 초점을 맞춥니다. 이어서 콘덴서 필드의 육각형 가장자리에 초점을 맞춥니다. 중앙 쾰러 조명(central Kohler illumination)과 일치하도록 정렬한 후 멈춥니다.

육각형 모서리가 접안렌즈 중앙에 위치하도록 하고 초점을 정확하게 맞추십시오. 그런 다음 콘덴서 field stop 위치 조절 노브를 사용하여, 시야 중앙에 콘덴서 field stop을 맞추십시오. IP lab을 실행하고 카메라 작동을 위한 설정을 입력하십시오.

카메라가 프레임 전송 모드로 설정되어 있는지 확인하십시오. 라이브 미리보기를 시작하려면 초점 획득 명령을 실행하십시오. 그런 다음 인덱스 접두사와 이미지가 저장될 파일 위치를 설정하십시오.

다음으로, RS 이미징을 시작합니다. Cool Snap 카메라 작동 설정을 지정하십시오. 클러킹 모드는 일반(normal)으로 설정해야 합니다.

DMD 소프트웨어를 시작합니다. 스크립트 메뉴에서 암시야 조리개(dark field iris)를 설정합니다. 그다음 로드(load)와 리셋(reset)을 클릭합니다.

스크립트를 수동으로 실행하려면 뷰포트의 현미경 optiv 바를 LSM으로 설정하십시오. 이렇게 하면 정렬된 광학계를 통해 DMD로 이미지가 전송됩니다. 암시야 이미지가 Cascade five 12 카메라의 CCD에 투영됩니다.

IP lab의 라이브 미리보기에 암시야 이미지가 나타나야 합니다. 필요한 경우, 라이브 미리보기에서 이미지의 초점을 맞추십시오. 이미지에서 신호 값이 최소 10,000 counts가 확보될 수 있도록 노출 시간을 충분히 높게 설정하십시오.

그 다음, 획득 후 acquire single 명령을 사용하여 시야의 스냅샷을 촬영합니다. save as indexed 명령을 사용하여 이미지를 디스크에 저장합니다. GTI 이미지는 시야의 크기를 측정합니다.

이제 GTI 샘플을 시야 밖으로 이동시켜 배경만 보이게 하십시오. 최소 5,000 counts를 얻기에 충분한 노출 시간으로 해당 영역의 배경 이미지를 캡처합니다. 이 이미지는 필터링되지 않은 이미지의 배경 감산에 활용됩니다.

이제 배경의 Gabor 필터링된 이미지를 획득하기 위해 DMD 제어 소프트웨어에 Gabor 필터 뱅크 스크립트를 로드하십시오. 스크립트 전체를 실행하여 필터들을 DMD의 온보드 메모리에 버퍼링합니다. 전체 스크립트가 버퍼링되는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.

DMD 소프트웨어 내의 시작 및 종료 마커를 사용하여 한 번에 하나의 Gabor Like 필터에 대응하는 한 세트의 필터만 로드되도록 하십시오. 스크립트를 실행하여 배경의 필터링된 이미지를 획득합니다. 라이브 이미지 미리보기가 암시야(dark field)에서 필터링된 이미지로 변경되어야 합니다.

해당 필터의 경우, 디스크의 IP lab에서 획득 스크립트를 엽니다. 최소 2000 counts가 획득될 수 있도록 노출 시간을 조정하십시오. DMD 스크립트가 실행되는 동안 IP lab의 라이브 미리보기를 취소하고 획득 스크립트를 실행하십시오.

이렇게 하면 자동으로 인덱스를 획득하고 필터링된 이미지를 디스크에 저장합니다. 첫 번째 이미지가 획득되면 DMD에서 실행 중인 스크립트를 중지하십시오. 스크립트에서 사용한 명령어를 삭제하십시오.

그 다음, 다음 필터 세트의 시작 및 종료 마커를 교체합니다. 전체 필터 뱅크를 모두 사용하고 모든 필터링된 이미지를 획득 및 저장할 때까지 IP 실험실에서 획득 과정을 반복합니다. 실험대 위에 납땜 인두를 연결하고 L 15 배지를 37 °C로 가열하여 세포 도말 준비를 합니다.

키친타월과 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 흘린 배지를 흡수하고 주변 영역을 청결하게 유지할 수 있는 작업대를 조성합니다. 킴와이프를 찢고 꼬아서 여러 개의 심지를 준비합니다. 이 심지들은 셀 플레이트에서 액체를 끌어당기는 데 사용됩니다.

다음으로, 금속 샘플 홀더를 사용하여 셀 샌드위치를 제작합니다. 주사기를 사용하여 가공된 금속 플레이트의 구멍 상단 주변부와 양측 홈 끝부분의 약 절반 정도까지 진공 그리스를 얇게 도포합니다. 깨끗한 1번 커버슬립을 그리스 위에 조심스럽게 덮습니다.

플레이트를 뒤집고 구멍 주변에 그리스를 바릅니다. 에탄올로 멸균한 NI trial 시험용 장갑을 착용한 상태에서 실내 조명을 끕니다. 배양기에서 세포를 꺼냅니다.

6-well 플레이트에서 실험에 사용할 커버슬립을 꺼냅니다. 커버슬립을 조심스럽게 건조시킵니다. 그런 다음 관찰 구멍 위의 그리스가 칠해진 금속 플레이트에 커버슬립의 세포 접촉면이 아래로 향하도록 눌러 고정합니다.

플레이트 내에 세포를 샌드위치 형태로 배치합니다. 공기 층이 남지 않았는지 확인하고, 배지를 주입할 수 있도록 그리스가 수밀 씰을 형성했는지 확인하십시오. 이제 플레이트를 다시 뒤집어 한 번에 200 µL씩 피펫팅합니다.

상단 커버슬립과 금속판 사이의 홈을 통해 미리 데워둔 L 15 배지를 액체가 반대편 홈에 거의 도달할 때까지 샌드위치 구조 내에 추가합니다. 다음으로, 반대쪽 홈에 위크(wick)를 대고 200 µL의 배지를 추가로 피펫팅하여 세포를 세척합니다. 위크가 기존 배지를 제거함에 따라 배지가 한쪽에서 다른 쪽으로 흐르게 됩니다.

이 단계에서는 액체 내에 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 세척 시마다 새로운 위크(wick)를 사용하여 이 과정을 2~3회 반복합니다. 이제 플레이트의 가장자리를 지지한 상태로 다시 한번 뒤집어 셀 저장조(cell reservoir)에 액체가 갇히도록 합니다.

납땜 인두를 veap 비커에 담가 veap의 일부를 빠르게 녹이면, 녹은 veap가 인두 팁에 달라붙습니다. 납땜 인두 팁을 사용하여 녹은 veap를 하단 커버 슬립의 가장자리를 따라 조심스럽게 도포하십시오. 커버 슬립의 둘레를 따라 이 과정을 반복하여 도포함으로써, 커버 슬립을 금속판에 밀봉하십시오.

이렇게 하면 견고한 기계적 밀봉이 형성되어 관찰 중에 커버 슬립이 플레이트에서 분리되지 않습니다. 바닥면의 잔여물을 깨끗이 제거하십시오. 킴와이프(Kimwipe)를 뭉쳐 커버 슬립 표면을 닦아 청결하게 유지하십시오.

커버 슬립의 중심부가 관찰 시 가장 깨끗한 상태가 되도록 한 번의 미끄러지는 동작으로 밀어 넣으십시오. 6구 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 플레이트가 담긴 세포를 광학 실험실로 가져가 대물렌즈에 장착하십시오.

이전과 마찬가지로, 건강해 보이는 세포 영역을 찾아 해당 시야의 암시야 이미지를 획득하십시오. 그런 다음 현미경을 DIC 모드로 정렬하고 노출 시간이 적절한지 확인하십시오. 그 후 cascade 카메라를 사용하여 DIC 이미지를 획득하십시오.

이 설정에서는 현미경이 여전히 DIC 상태로 정렬된 동안 cool SNAP 카메라를 사용하여 형광 이미지를 획득합니다. 현미경 VAR를 1배로 설정하고 뷰포트를 100% binocular로 설정한 다음, 접안렌즈에서 카메라로 이미지를 분산시킵니다. 시야를 조명하기 위해 콘덴서 위에 청색 LED를 배치하십시오.

그런 다음 RSS 이미지로 시야를 미리 확인하고 미세 초점을 조절합니다. 필요한 경우, DIC 이미지를 획득하여 디스크에 저장합니다. 시야가 캐스케이드 카메라에서 얻은 시야와 어떻게 다른지 확인하십시오.

이 이미지들은 실험의 분석 단계에서 정합 과정을 거쳐야 합니다. 다음으로, 형광 필터 큐브를 제자리에 놓고 현미경 셔터를 사용하여 형광 여기 광원을 짧게 켜서 형광 이미지를 획득한 후, 획득이 완료되는 즉시 광원을 끕니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 형광 이미지를 디스크에 저장하십시오.

필터링된 이미지를 얻으려면, 현미경을 시야(field)로 재설정하고 빛을 LSM 포트로 보내십시오. 이전과 마찬가지로, 세포가 여전히 스테이지 위에 있고 시야가 흐트러지지 않은 상태에서 전체 Gabor 필터 뱅크 스크립트를 실행하여 한 시점의 데이터 획득을 완료하십시오. 위킹(wicking) 방법을 사용하여 일반 L 15 배지를 1 µM STS 용액이 포함된 배지로 교체하십시오.

실험 과정 중에, 세포 플레이트를 스테이지에서 제거하거나 시야를 방해하지 않고 플레이트의 홈에 배지를 피펫팅하여 추가함으로써 건조되는 것을 방지하십시오. 이제 실험이 완료될 때까지 이후의 시간대별로 이 단계들을 반복하십시오. 수집된 데이터에는 세포 내 구조 데이터를 추출하기 위해 처리해야 하는 다수의 필터링된 이미지가 포함됩니다.

여기 두 가지 예시 실험이 제시되어 있습니다. 이 그림은 해양 규조류 조류 샘플의 연속 이미지를 보여줍니다. 정렬된 특징들이 명확하게 보입니다.

암시야 이미징 결과입니다. 5=0도부터 5=160도로 표시된 광학 필터링 이미지들이 샘플의 필터링되지 않은 이미지와 함께 제시되어 있습니다. 비교를 위해, 규조류의 Gabor 필터링 이미지 9개 세트를 객체 방향에 따라 픽셀 단위로 처리하였습니다.

각 픽셀에서 필터 방향에 따른 최대 신호를 평균 신호로 나누어 종횡비 값을 산출하였습니다. 여기서 파란색으로 표시된 1에 가까운 종횡비는 선호하는 응답 각도가 없는 영역을 나타냅니다. 빨간색으로 표시된 더 큰 값은 더 높은 선호 각도 응답이 나타나는 영역을 나타냅니다.

전체 GABOR 필터 응답의 밝기와 코드 유의성, 그리고 각 픽셀에서 최대 신호를 주는 필터 방향은 기저 객체 방향의 수직 방향에 해당합니다. 하부 구조 입자의 방향은 퀼버 플롯(quiver plot)으로 인코딩되며, 여기서 각 선은 필터링 되지 않은 암시야(dark field)에서 보이는 기저 국소 객체 방향과 밀접하게 일치합니다. 퀼버 플롯은 응답 강도가 최대치의 10%보다 큰 객체들의 방향을 보여줍니다.

살아있는 소 내피세포가 포함된 시야의 암시야 및 광학 필터 이미지들로, 필터 이미지는 세포 사멸 유도제인 staurosporin 처리 후 3시간 동안 20분마다 획득되었습니다. 여기서 상단 패널의 종횡비 맵과 하단 패널의 미토콘드리아 형광 이미지가 시간의 함수로 표시되어 있습니다. 색조는 배향도를 나타내며, 이전과 마찬가지로 이 시간 그래프들은 staurosporin 처리된 내피세포 내 입자 종횡비의 배향도 감소를 비교합니다. 개별 트레이스는 단일 세포 내에서의 시간 그래프를 나타냅니다.

드롭인 지향성은 형광 영역과 일치하는 세포 영역으로 한정됩니다. 이제 형광을 통한 검증이 완료되었습니다. 이는 기록으로 남게 됩니다.

따라서 다음 실험에서는 형광 이미징 단계를 생략하고 광산란법을 직접 사용하여 미토콘드리아 측정을 수행할 수 있습니다. 지금까지 Gabor 필터 기반의 광산란 시그니처를 이용하여 세포 사멸 중 미토콘드리아 분절화를 모니터링하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 적절한 시료 준비가 중요하며, 광학 설정이 잘 정렬되고 보정되었는지 확인해야 합니다.

그럼 UI 실험을 위한 관찰 및 CoLab 활용 방안을 살펴보겠습니다.