비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

본 프로토콜은 비디오 이미징용 카메라가 장착된 icon bio station CT 인큐베이터에서 수집한 타임랩스 비디오를 분석하여 인간 배아줄기세포 콜로니 성장을 측정하는 비디오 생물정보학 방법을 시연합니다. 인간 배아줄기세포 또는 HESC 콜로니를 70% 합류도까지 배양한 후 재도말하고 48시간 동안 배양하며, 이후 Biot ct에서 HESC 콜로니를 추가로 48시간 동안 촬영합니다. 성장률은 CL quant 소프트웨어로 개발된 세그멘테이션 강화 및 측정 레시피를 사용하여 결정합니다.

이 레시피들은 각 콜로니에 대해 정밀한 수동 마스크 피팅이 가능한 이미지 분석 도구인 Adobe Photoshop과의 비교를 통해 검증되었습니다. 비디오 바이오인포매틱스라는 신흥 분야는 현미경 비디오로부터 생물학적 데이터의 처리, 분석 및 마이닝을 자동화하는 데 사용될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 리버사이드 캠퍼스 세포생물학 및 신경과학과의 Dr. Prou Talbot 연구실 소속 Serena Lin입니다.

안녕하세요, Talbot Lab의 Sean Fino입니다. 안녕하세요, 세포 분자 및 발생 생물학 대학원 프로그램의 TI Satish입니다. 오늘은 비디오 생물정보학 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 콜로니의 성장을 측정하는 방법을 보여드리겠습니다.

당사 연구실에서는 환경 독성 물질이 인간 배아 줄기세포의 거동에 미치는 영향을 측정하기 위해 이 절차를 사용합니다. 새로운 줄기세포 코어 시설에서 이 절차를 시연하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

비디오 분석을 위해 HESC를 준비하려면, Matrigel이 코팅된 6-well 플레이트에서 HESC를 70% 밀도로 성장할 때까지 배양합니다. HESC가 포함된 well에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 PBS로 두 번 헹굽니다. 1 mL의 Accutane을 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1분 동안 배양합니다. 다음으로, well에 10~12개의 유리 비드를 넣고 콜로니가 완전히 떨어져 나갈 때까지 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다.

1 mL의 인간 배아줄기세포 유지 배지 또는 마우스 배아 섬유아세포 조건화 배지를 사용하여 Accutane을 중화합니다. 비즈가 없는 분리된 세포를 15 mL 원심분리관에 수집하고 200 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 500 µL의 신선한 인간 배아줄기세포 유지 배지 또는 M-T-E-S-R로 펠렛을 풀어줍니다. HESC 현탁액 100 µL를 Matrigel이 코팅된 12-웰 플레이트의 여러 웰에 한 방울씩 떨어뜨려 분주합니다.

플레이트를 앞뒤로 살살 흔든 후, 광학 현미경으로 배양물을 관찰하여 세포 덩어리가 웰 전체에 고르게 분포되었는지 확인합니다. 세포가 평평하게 부착되고 쉽게 시각화할 수 있을 만큼 충분히 커지도록 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 배지를 흡입하여 제거하고 500 µL의 PBS로 웰을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 다음, 각 웰에 500 µL의 M-T-E-S-R 배지를 첨가합니다.

즉시 플레이트를 Biot CT에 넣고 타임랩스 이미지를 수집하기 시작합니다. 다른 콜로니와 겹쳐 자랄 가능성이 낮은, 독립된 단일 콜로니가 있는 시야를 선택하십시오. 이 프로토콜에서는 7분 간격으로 프레임을 설정하여 48시간 동안 세포를 비디오 녹화합니다.

세그멘테이션 레시피를 먼저 만들려면, 전체 비디오를 수동으로 스캔하여 녹화 기간 내내 초점이 유지되는 단일 콜로니가 포함되어 있는지 확인하십시오. 그 후, CL quants 소프트웨어에서 세그멘테이션 마법사를 열고 다음 버튼을 클릭하십시오. 올바른 이미지 채널을 선택하고 다음 버튼을 클릭하십시오.

Soft matching을 선택하고 Next를 클릭하십시오. 콜로니의 외곽 가장자리에서 중심 영역까지 원을 그려 하나 또는 두 개의 관심 영역을 선택하십시오. 이 영역은 가능한 한 작게 설정하되, 전체 콜로니를 대표할 수 있어야 합니다.

너무 많은 영역을 선택하면 마스크 적용이 부정확해질 수 있으므로 주의하십시오. 다음 버튼을 클릭하십시오. 콜로니의 일부가 아니며 배경의 일부도 아닌 영역을 원으로 그려 '영역 제외(Don't want regions)'를 선택하십시오.

이 영역들에는 잔해나 죽은 세포와 같이 억제해야 할 패턴이 포함되어 있습니다. '다음'을 클릭하십시오. 콜로니, 잔해 또는 죽은 세포가 아닌 영역을 원으로 그려 배경을 선택하십시오.

배경은 균일해야 하며 모든 프레임에서 나타날 가능성이 높아야 합니다. 일반적으로는 콜로니 주변의 회색 배경을 선택합니다. 다음 버튼을 클릭하십시오.

마스크가 관심 영역을 정확하게 덮지 않는 경우, 관심 영역 위에 유색 마스크가 표시되어야 합니다. 마스크 변경이 필요한 경우 화면 오른쪽 하단의 세그멘테이션 임계값 범위를 증가시키거나 감소시킬 수 있습니다. 소프트 매칭 영역 업데이트를 선택하십시오.

이를 통해 선택 영역(want), 제외 영역(don't want) 또는 배경 영역을 변경할 수 있습니다. 마스크가 만족스럽다면 'apply threshold'를 선택하고 'save my mask'를 클릭하십시오. 그런 다음 'next' 버튼을 클릭하십시오.

그러면 마스크가 다른 색상으로 표시됩니다. 완료(finish)를 선택하십시오. 소프트웨어의 우측 상단에 세그멘테이션 레시피(segmentation recipe)로 해당 레시피가 표시되어야 합니다.

원하는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 새 이름을 입력하여 레시피 이름을 변경하십시오. 레시피를 적용하려면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 올리십시오.

레시피를 적용합니다. 사용할 프레임 수를 선택할 수 있는 메뉴가 나타납니다. 마스크의 정확도를 보장하기 위해 프레임 간격을 20프레임마다로 설정하십시오.

마스크가 적용된 프레임의 10%를 무작위로 수동 점검하여 데브리(debris) 내의 불필요한 영역을 제거하는 강화 레시피(enhancement recipe)를 생성하십시오. 강화 레시피 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 '새로 만들기(new)'를 클릭하십시오. 그러면 원래의 시야(field of view)로부터 새로운 강화 레시피가 표시됩니다.

툴바의 아이콘 위에 마우스를 올려 이미지 오른쪽에 위치한 토글 강화 모듈 버튼을 확인한 후 클릭하십시오. 라벨링 드롭다운 메뉴를 선택하십시오. 연결된 라벨링을 선택하고 연결된 두 가지 라벨링을 선택하십시오.

새로운 작업 표시줄이 나타나야 합니다. 세그멘테이션 레시피에서 초기 마스크를 가져와 입력창으로 드래그하십시오. 이제 표시줄에 입력 마스크 번호가 표시되어야 합니다.

입력 마스크 번호가 표시된 아이콘을 마스크 0 아이콘으로 드래그하십시오. 작업 표시줄에서 min size를 찾아 관심 영역(region of interest)만 표시될 때까지 숫자를 조정하십시오. 각 피팅 시도마다 반드시 execute를 클릭하십시오.

최소 크기 조정이 만족스럽게 완료되면, 화면 하단의 이전 강화 레시피(enhancement recipe)를 클릭하고 '레시피에 저장(save to recipe)'을 선택하십시오. 그러면 소프트웨어에서 선택한 레시피를 덮어쓸 것인지 묻는 창이 나타나는데, 이때 '예(yes)'를 선택하십시오. 스팟 세그멘테이션(spot checking segmentation) 확인과 동일한 절차를 사용하여 강화 레시피를 확인하십시오.

세그멘테이션 및 강화 레시피에 만족한다면, 이어서 측정 템플릿을 생성하십시오. 시작하려면 우측 툴바에서 측정 템플릿 생성(create measurement template)을 선택하십시오. 측정 창에서 커서를 클립 아트 세포 도형 위로 이동시키십시오.

Control 키를 누른 상태에서 morphology 섹션 아래의 셀을 선택하고, default parameter 체크를 해제한 뒤 area parameter를 체크하십시오. 그런 다음 템플릿 창을 닫고 아이콘을 선택하십시오.

측정 레시피를 생성합니다. 레시피의 이름을 변경합니다. 템플릿 탭으로 이동하여 선택합니다. 우측 상단에서 이전에 생성한 측정 템플릿을 측정 창으로 드래그 앤 드롭합니다.

측정 레시피 창에서 '예'를 클릭하여 계속 진행한 후, 채널 매핑(channel mappings)을 선택하십시오. 그런 다음 전체 세포 선택 마스크 매핑(whole cell select mask mappings)을 선택하십시오. 이어서 전체 세포(whole cell) 옵션을 선택하십시오. 향상된 마스크의 경우, 레시피 탭에서 측정 레시피를 선택하십시오.

메인 창에서 측정 레시피 창 내의 저장 아이콘을 선택하십시오. 그런 다음 창을 닫으십시오. 이어서 시야(field of view)를 닫았다가 다시 엽니다. 레시피 목록 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 '새로 만들기'를 클릭하고, 필요한 적용 순서대로 레시피를 레시피 목록으로 드래그하십시오. 레시피 목록 잠금을 선택한 후, Adobe Photoshop을 사용하여 비디오 데이터에 레시피를 순차적으로 실행하십시오.

동일한 콜로니의 매 20번째 프레임을 분석하였습니다. Adobe Photoshop에서 콜로니 이미지의 프레임을 수동으로 엽니다. 툴바에서 자동 선택 도구(magic wand tool)를 클릭합니다.

콜로니 주변 영역을 클릭하여 콜로니 영역을 제외한 전체 필드가 선택되도록 하십시오. 콜로니를 둘러싼 점선이 콜로니 내부가 아닌 가장자리에 정확히 맞는지 확인하십시오. 점선이 가장자리에 맞지 않는 경우, 상단 도구 모음에서 허용 오차(tolerance) 값을 적절하게 변경하십시오.

툴바에서 퀵 마스크(quick mask) 모드의 편집(edit)을 클릭하고, 콜로니를 클릭하여 선택합니다. 윈도우 풀다운 메뉴로 이동하여 히스토그램(histogram)을 클릭합니다. 캐시(cache)는 1로 설정되어 있어야 합니다.

캐시가 2인 경우, 느낌표 표시의 expression mark를 클릭하여 캐시를 1로 변경하십시오. 픽셀 값을 스프레드시트에 기록하십시오. 매 20번째 프레임마다 위 과정을 반복하십시오.

Photoshop 및 CL quant 소프트웨어를 사용하여 수집한 데이터를 함께 도식화할 수 있습니다. HESC 콜로니 성장을 정량화하기 위한 본 프로토콜은 비디오 바이오인포매틱스를 생물학적 문제에 적용한 한 사례를 보여줍니다. 여기에서는 CL quant 소프트웨어와 Adobe Photoshop을 사용하여 측정한 48시간 동안의 콜로니 크기 증가량을 비교한 그래프를 제시합니다.

그래프는 두 가지 소프트웨어 패키지로 각각 분석한 다섯 가지의 서로 다른 콜로니를 보여줍니다. 각 콜로니는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 실선은 sail quant 소프트웨어를 사용하여 도출되었으며, 점선은 Photoshop을 사용하여 수집되었습니다.

원시 데이터 그래프를 통해 두 가지 측정 방법 모두 콜로니의 초기 크기가 서로 다르다는 점을 고려했을 때 잘 일치함을 알 수 있습니다. 이 그림은 데이터를 콜로니 크기의 증가율(%)로 다시 도식화하여 보여줍니다. 성장률은 초기 콜로니 크기와 관계없이 유사하며, 두 가지 분석 측정법 모두 비슷한 결과를 나타냅니다.

다음 그래프는 HESC 콜로니 성장의 이전 퍼센트 변화 데이터의 평균값을 보여줍니다. 이 그래프는 비디오 바이오인포매틱스와 Adobe Photoshop을 사용하여 수행한 분석 결과가 서로 잘 일치함을 명확하게 보여줍니다. 지금까지 비디오 바이오인포매틱스 도구를 사용하여 인간 배아 줄기 세포 콜로니 성장을 측정하는 방법을 살펴보았습니다.

위상차 현미경을 사용하여 이 절차를 수행할 때는 소프트웨어가 콜로니를 정확하게 선택할 수 있도록 콜로니 주변의 헤일로(halo)를 반드시 포함하십시오. 또한, 저희가 시연한 프로토콜 대신 배양, 인큐베이션 및 비디오 수집을 위한 다른 방법들을 사용할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 레시피가 개발되고 검증되면, 수동 분석보다 훨씬 빠르게 분석을 수행할 수 있으며 실험적 변동성도 줄어들 것입니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.