만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

본 절차의 전체적인 목표는 만성 살모넬라 감염 마우스 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 살모넬라 용액을 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 마우스에게 스트렙토마이신을 가바지(gavage) 투여한 후 살모넬라를 투여하거나, 스트렙토마이신만 투여하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 마우스 분변에서 salmonella를 분리하고, BL chroma 플레이트를 사용하여 마우스 장 내의 salmonella 감염을 검출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 마우스의 체질량을 관찰 및 기록하고, salmonella 감염 이후의 활성도 변화를 확인하는 것입니다. 최종적으로, salmonella를 경구 투여(gavage)한 마우스의 장 내에 salmonella 감염이 성립될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 의과대학 Johnson 박사님 연구실의 Michelle P입니다. 저는 Sun 연구실 소속이며, 저는 Sun 연구실의 Y입니다. 오늘은 Alytic Lennar 감염 종양 모델을 구축하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 숙주-박테리아 상호작용 신호 전달 및 종양 발생을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 실험 전, 각 salmonella 균주에 맞게 실험 전체 과정에서 사용할 충분한 양의 Luria-Bertani 또는 LB 배지 플레이트를 준비하십시오.

플레이트는 냉장 보관하여 수개월 동안 저장할 수 있습니다. 다음으로, 살모넬라 배양액을 준비합니다. -80 °C에서 냉동 보관된 살모넬라 스톡 바이알을 꺼내어 상온에서 해동한 후 살모넬라를 플레이트에 도말합니다.

백금이를 버너 불꽃으로 가열한 후 해동된 박테리아 스톡에 담급니다. LB 플레이트의 상단 3분의 1 영역에 백금이를 지그재그 방향으로 앞뒤로 도포합니다. 백금이를 다시 화염 멸균하고 플레이트를 회전시킵니다.

루프를 지그재그로 움직여 이전 스트리크와 교차시키며 플레이트의 두 번째 구역에 박테리아를 도포합니다. 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 루프를 다시 화염 멸균합니다.

루프가 한천에 박히지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 37 °C 배양기에 넣고 하룻밤 동안 보관하여 콜로니를 성장시킵니다. 올바르게 수행되었다면, 살모넬라 플레이트의 적어도 한 구역에서는 개별 콜로니가 형성되어야 합니다.

다음 날, 멸균된 이쑤시개나 백금이를 사용하여 LB 플레이트에서 클론을 선택하고, 12 mL 튜브에 7 mL의 LB 배지를 넣은 후 옮겨줍니다. 튜브를 37 °C에서 약 5시간 동안 진탕 배양합니다.

이 배양액 0.05 milliliters를 사용하여 Falcon 튜브에 담긴 50 milliliters의 LB에 접종합니다. 37 °C에서 약 18시간 동안 흔들지 않고 배양합니다.

50 milliliter의 세균 하룻밤 배양액을 상온에서 5,000 RPM으로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 그다음, 튜브에 1.5 milliliters의 Hank's buffered salt solution(HBSS)을 넣어 세균을 재현탁합니다. 이는 LB와 HBSS의 비율이 100:3인 조건입니다. 이후 HBSS를 추가하여 총 부피를 15 milliliters로 맞춥니다. 이는 LB와 HBSS의 비율이 1:10인 조건입니다.

각 마우스에게는 100 µL의 희석된 살모넬라 배양액, 즉 1×10⁶ ~ 1×10⁸ CFU가 필요하며, 경구 투여 시작 4시간 전에 마우스의 물과 사료 공급을 중단합니다. 그다지 경구 투여 직전에 7.5 mg의 스트렙토마이신 분말을 100 µL의 HBSS에 희석하여 스트렙토마이신 용액을 준비합니다. 각 마우스에 주입할 때, 경구 투여 전 손실분을 고려하여 여분의 용량을 충분히 준비하십시오.

먼저, 스트렙토마이신 용액 100 µL가 충전된 경구 투여용 바늘을 준비합니다. 가바지(gavage)를 수행할 첫 번째 마우스를 케이지에서 꺼내 실험대 방향을 향하도록 잡습니다. 엄지와 중지로 마우스의 어깨 위 피부를 단단히 잡고, 검지로 머리와 목을 당겨 식도를 일직선으로 펴줍니다.

급여 바늘의 볼 팁을 입천장을 따라 인두 뒷부분의 오른쪽으로 향하게 합니다. 그런 다음 부드럽게 식도로 통과시켜 100 µL의 스트렙토마이신 용액을 주입합니다. 이때 저항감이 느껴지지 않아야 합니다.

실험군과 대조군에 속한 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 스트렙토코쿠스(strep) 투여 및 가바주(gavage) 후 약 20시간이 지나고 살모넬라(salmonella) 가바주 4시간 전에, 경구로 살모넬라 가바주를 받을 마우스의 물과 먹이를 제거합니다. HBSS 내의 살모넬라 용액 100 µL를 사용하여 이전과 동일한 방식으로 각 마우스에 가바주를 실시합니다.

강제 경구 투여 후, 분변 수집을 시작하기 위해 각 마우스를 새 케이지로 옮깁니다. 투여 후 약 8시간부터 분변이 배출되는 즉시 케이지에서 제거합니다. 실험 샘플로 마우스 분변 100 milligrams를 수집합니다.

분변 내 salmonella 분석을 위해 연구 기간에 따라 매일 또는 매주 샘플을 수집합니다. 분변 샘플을 1 mL의 PBS가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 강하게 vortexing하고 800 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮겨 6,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 펠릿에 200 µL의 PBS를 첨가한 후 볼텍싱하여 재현탁합니다. 다음으로, BB l roag 플레이트를 사용하여 살모넬라를 검출합니다. 플레이트당 10에서 100 µL의 분변 용액을 사용하며, 섹션 2에 표시된 것과 같이 플레이트에 도말합니다.

선택된 발색제가 있을 때 대사 차이로 인해 살모넬라 종은 적색으로 나타납니다. 플레이트 위의 살모넬라 콜로니 수를 측정하여 개별 마우스 간의 감염 수준을 비교하십시오. 본 실험 절차에서는 6~7주 된 특정 병원균 제거(SPF) 암컷 C 57 black six 마우스를 사용하였습니다.

마우스에 살모넬라와 스트렙토마이신 및 HBSS를 감염시켰습니다. 대조군 마우스에는 스트렙토마이신만 경구 투여하였습니다. 사용된 살모넬라 균주는 살모넬라 typhimurium 야생형 균주 A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, 비병원성 살모넬라 변이 균주, 그리고 low copy 플라스미드 PSKW 29에 병원성 관련 AAV R age 유전자를 포함하고 있는 James Madera 박사 연구실의 세 가지 FPC 균주입니다. 이 프로토콜을 통해 마우스 장내의 살모넬라 tyrian 정착을 검출할 수 있습니다.

만성 살모넬라 감염은 분변 분석을 통해 측정하였으며, 면역형광 염색을 위해 체중 및 장 조직 샘플을 수집하였습니다. 일반적으로 체중 감소와 폐사는 감염 후 4주 이내에 발생합니다. 감염 후 4주 시점의 생존율이 여기에 제시되어 있습니다.

감염 후 4주가 지나 생존한 마우스는 이후 23주 동안 체중이 증가하며 사망률이 감소합니다. 전반적으로 salmonella 균주인 FSY fsy, A VRA null 또는 fsy. A VRA 이형접합체에 감염된 마우스의 65% 이상이 장내에 지속적인 salmonella 감염이 있는 상태로 6개월 이상 생존할 수 있습니다.

급성 감염 이후에도 생존 개체들은 여전히 살모넬라를 보유하고 있었으며, 이는 본 프로토콜에 기술된 방법을 사용하여 감염 6개월 후에 검출될 수 있었습니다. 마우스 장 조직 샘플의 면역형광 분석 결과, 감염 27주 후에 장점막으로 살모넬라가 침입한 것이 확인되었습니다. 이 이미지에서 핵은 파란색으로 염색되었으며, 살모넬라 감염 부위는 녹색으로 표시되었습니다.

대조군에서 보는 바와 같이, 밝은 녹색 염색이 나타나지 않으며 이는 살모넬라(salmonella) 정착이 일어나지 않았음을 나타냅니다. 반면, 감염 후 27주가 된 살모넬라 감염 쥐의 경우, 장 점막에서 밝은 녹색 염색이 관찰됩니다. 이는 스트렙토마이신(streptomycin)을 전처리한 쥐에서 살모넬라 감염이 지속되고 있음을 보여줍니다.

지금까지 마우스 모델에서 일부의 만성 감염을 유도하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 접종을 위해 배양물을 신선하게 준비하고, 정확한 접종 기술을 구사하며, 실험 모델이 제대로 작동하고 있는지 확인하기 위해 ANA의 존재 여부를 검출하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이상입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.