진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 세포 용해물에서 모노솜(mono zone) 분획과 폴리리보솜(poly ribosome) 분획을 분리하고 비교하는 것입니다. 이를 위해 먼저 대상 세포를 배양합니다. 절차의 두 번째 단계는 세포 용해물을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 용해물을 수크로스 밀도 구배를 통해 원심분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 구배를 분획하고 UV trace를 통해 서로 다른 리보솜 집단을 시각화하는 것입니다. 궁극적으로, 폴리리보솜 프로파일 분석을 통해 다양한 실험 조건 하에서 번역의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 UMD 및 J Robert Wood Johnson 의과대학 분자유전학, 미생물학 및 면역학과의 Terry Goss Kinsey 박사 연구실의 Anthony Esposito입니다. 그리고 저는 여기 R-W-J-M-S의 Kinsey 연구실 소속 Marcus Lewis입니다.

오늘은 폴리리보솜 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 돌연변이나 환경적 요인으로 인해 발생하는 단백질 합성의 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. Sucrose.

농도 구배가 연속적으로 형성될 수 있도록 사용 하루 전에 준비해야 합니다. 7% 및 47% 자당 스톡 용액을 적절한 부피로 혼합하여 7%, 17%, 27%, 37% 및 47%의 각 자당 농도 용액을 48 milliliters씩 제조합니다. 각 자당 용액에 1 molar DTT를 최종 농도 1 millimolar가 되도록 첨가합니다. 농도 구배를 붓기 위해, 파스타 피펫을 20 milliliter 주사기에 부착하고 파라필름으로 고정하여 밀봉합니다.

1인치 x 3.5인치 폴리아머 울트라 원심분리 튜브 바닥에 7% sucrose 7 mL를 넣습니다. 다음으로, 파스퇴르 피펫 팁을 튜브 바닥 근처에 위치시킨 뒤 천천히 피펫팅하여 7% 용액 아래에 17% sucrose 용액 7 mL를 추가합니다. 각 층을 붓는 데 최소 20초 이상이 소요되어야 합니다.

구배가 형성되면 27%, 37% 및 47% sucrose 용액을 각각 7 mL씩 사용하여 반복하십시오. 층 사이에 명확한 경계선이 관찰되어야 하며, 이는 혼합이 최소한으로 일어났음을 나타냅니다. 모든 구배를 로터, 병 및 샘플 수집에 사용할 튜브와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

효모 세포 추출물을 준비하려면, 먼저 25 mL 효모 배양액 100개를 OD 600 0.8에서 1 사이가 될 때까지 배양합니다. 배양액에 cycloheximide를 최종 농도 100 µg/mL가 되도록 첨가하고 30 °C에서 15분 동안 계속해서 흔들어 섞어줍니다. 15분 후, 배양액을 250 mL 원심분리 병에 붓고 얼음으로 채웁니다.

이 시점부터 모든 시료를 얼음 위에 유지하십시오. 4 °C에서 8,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 10 mL의 차가운 용해 완충액(lysis buffer)에 재현탁하고, 15 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 5,900 ×g로 3분 동안 원심분리합니다.

펠렛을 0.5 milliliters의 용해 버퍼에 현탁합니다. 현탁액을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리관으로 옮긴 다음, 냉각된 산 세척 유리 비드 0.5 milliliters를 추가합니다. 세포를 32분의 1초 간격으로 4회 볼텍싱하며, 각 간격 사이에 튜브를 얼음 위에 30초 동안 둡니다.

그런 다음 1.5 mL 튜브에 lysis buffer 0.5 mL를 추가로 넣고 4 °C에서 5,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다.

마지막으로, 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 추출물은 용해물을 자당 밀도 구배(sucrose gradient)로 옮기기 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 피펫 팁을 구배 표면 근처의 튜브 벽면에 대고 용해물을 구배 위에 조심스럽게 층을 이루어 올립니다.

35 mL 기울기 구배의 경우, 일반적으로 500 µL의 용해물을 로딩합니다. 포셉을 사용하여 기울기 구배 튜브를 스윙 버킷 로터의 버킷에 조심스럽게 넣습니다. 4 °C에서 100,000 ×g로 4시간 동안 기울기 구배를 원심분리합니다.

4시간 원심분리가 끝나기 약 30분 전에, 튜브 피어서(tube piercer)에 바늘을 장착하고 온라인 흡광 형광 모니터에 펜을 연결하십시오. 샘플을 분석하기 전 베이스라인이 안정화될 수 있도록 흡광 모니터의 전원을 켭니다.

DI 1 48 U 데이터 수집 장치를 연결하면 PolyZone 프로파일의 전자적 획득을 실시간으로 쉽게 수행할 수 있습니다. 차트 기록기를 사용하여, 역류 급속 설정을 통해 시린지 펌프에 florin nuts 50 milliliters를 채웁니다. 이때 기포가 없는지 확인하십시오.

주사기에서 튜브 피어서(tube piercer)로 호스를 연결하십시오. 그리고 Flo inert의 유량을 분당 6 mL로 설정하여 정방향으로 잠시 흘려줍니다. 호스 내의 기포를 제거하기 위해, 흐름 셀(flow cell) 끝단 호스 아래에 일련의 튜브를 배치하여 유출되는 샘플을 수집하십시오.

sucrose gradient가 들어 있는 원심분리 튜브를 고정할 수 있도록 미리 홈을 판 아이스 버킷을 준비합니다. 4시간의 원심분리가 완료되면, 원심분리 로터에서 원심분리 튜브를 조심스럽게 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 이때 gradient가 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

세포 추출물을 분석하려면, 그라디언트 튜브를 튜브 피어서(tube piercer) 위에 놓고 튜브 상단을 배출구에 연결하여 고정합니다. 바늘이 튜브 바닥을 관통할 수 있도록 하단 스테이지를 원심분리 튜브 방향으로 올립니다. Florin alert의 흐름을 순방향으로 6 mL/min 속도로 시작합니다.

액체가 튜브로 흐르기 시작하면 온라인 UV 흡광도 모니터의 바늘 움직임을 관찰하십시오. 바늘이 움직이기 시작하면 차트 이동 속도를 60으로 설정하여 켭니다. 폴리리보솜 프로필의 끝에 도달하면 원심분리 튜브로 흐르는 Flo inert의 흐름을 차단하고 흡광도 형광 모니터의 차트 이동을 중지하십시오.

흐름을 빠른 속도로 역방향으로 시작하여 원심분리 튜브 내의 Flo inert를 시린지로 회수하되, 튜브의 sucrose가 시린지로 흡입되지 않도록 주의하십시오. 튜브 피어서에서 원심분리 튜브를 돌려 뺀 다음, 바늘을 내리고 튜브를 제거하십시오. 여기서는 cyclo heide 존재 하에 효모로부터 준비된 리보솜 추출물의 대표적인 트레이스가 표시되어 있습니다.

폴리리보솜과 60 s 및 40 s 리보솜을 포함하는 UV 흡광 피크가 표시되어 있습니다. 지금까지 폴리리보솜 분석 수행 방법을 설명해 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 샘플을 차갑게 유지하고 RNA 분해 효소가 유입되지 않도록 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.