Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

다음 실험의 전반적인 목표는 30일 동안의 일련의 배양 단계를 통해 배아줄기세포로부터 희소돌기아교세포 전구세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 ES 세포로부터 배아체(embryo bodies)를 생성하여 세포 분화를 유도함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 배아체에 소분자인 레티노산(retinoic acid)과 순수 모르핀(pure morphine)을 처리하여 세포가 liga den으로 지향성 분화하도록 유도합니다.

세포 전구체. 세 번째 단계로, 22일이 더 지난 후 배아 본체를 단일 세포로 분리합니다. 배양 시, 세포의 약 80%가 OPC입니다.

다음으로, 스파이킹 OPC를 생성하기 위해 NAV 1.2 소단위체를 운반하는 bao 바이러스를 MESC 유래 OPC에 형질전환시킵니다. 면역형광 현미경 검사와 전기생리학적 기록을 통해 이러한 MESC 유래 OPC의 OPC 마커 발현과 스파이킹 특성을 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 세포생물학 및 인체해부학과의 Dr.Ing 연구실 소속 Pong Chiang입니다. 저희는 북가주 슈라이너 어린이 병원(Shriners Hospital for Children of Northern California)과도 협력하고 있습니다.

안녕하세요, Deng 연구실의 vial Raj입니다. 오늘은 마우스 배아 줄기세포를 희소돌기아교 전구세포로 분화시키는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 치료 잠재력이 더 뛰어난 세포를 생성하기 위해, 배아 줄기세포 유래 희소돌기아교 전구세포의 특성을 연구하는 데 이 절차를 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 오늘은 OG2 GFP 마우스 배아줄기세포주로부터 희소돌기아교세포 전구세포(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)를 생성해 보겠습니다. 이 배아줄기세포들은 최적의 밀도를 유지하여 건강한 상태를 유지하고 자발적 분화를 방지하기 위해 3일마다 계대 배양해야 합니다. 계대 배양 과정입니다.

층류 후드 아래에서 ESS 세포가 70% 밀도(confluence)에 도달했을 때, 배양액을 제거합니다. PBS로 헹군 후, 2 mL의 예열된 trypsin으로 처리합니다.

37°C에서 5분 동안 1회 LE express를 수행합니다. 반응을 중단하고 4 mL의 MES 세포 배지에 세포를 재부유시킵니다. 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴 후 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다.

MES 세포 배지 내에서 방사선 조사를 통해 합류층(confluent layer)을 형성한 meth 피더 세포 위에, 세포의 1/10 분량을 MESL 배지 플레이트에 재부유시킵니다. 3일 후 ES 세포가 약 70% 합류 상태가 되면 계대 배양을 하거나, 배아체(embryoid bodies)를 형성하여 분화를 유도할 준비가 된 것입니다. 이전과 동일하게 트립신(Trypsin)을 사용하여 마우스 ES 세포 콜로니를 처리한 다음, 세포를 knockout serum replacement 또는 KSR 배지에 재부유시킵니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)로 세포 수를 측정하고 KSR 내에서 현탁액을 희석합니다.

밀리리터당 15,000개의 세포가 포함된 배지 3mL를 초저부착 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 배양합니다. 부유 세포를 37°C에서 4일 동안 배양합니다. 배지는 2일마다 완전히 교체합니다.

4일째부터 매일 배지를 교체합니다. 4일째에는 KSR에 0.2 µM retinoic acid를 첨가하고, 5일째에는 retinoic acid와 1 µM primor famine을 모두 첨가하며, 6일과 7일째에도 동일하게 첨가합니다. 배아체(embryo bodies)를 0.2 µM retinoic acid와 1 µM primor famine이 첨가된 두 가지 배지로 배양합니다. 배양 8일 후, 대부분의 배아체에서 GFP가 발현되며, 이전과 동일하게 trypsin을 처리하여 세포를 분리하고 세포 수를 측정할 준비가 됩니다.

그런 다음 세포를 mL당 3.5 × 10⁵ cells 농도로 재현탁합니다. OPC 배지를 사용하여 현탁액 3 mL를 OPC 배지에 다시 분주합니다. 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine)이 코팅된 60 mm 디쉬를 사용하면 약 일주일마다 세포가 합류(confluent) 상태가 되며 이와 같은 모습이 됩니다. 이전과 동일하게 3분간의 트립신 처리(trypsinization)를 통해 세포를 계대 배양합니다.

최초의 재현탁 현탁액 조제 후 30일이 지난 시점입니다. KSR 배지에서 세포는 스파이킹(spiking) OPC를 생성하기 위한 희소돌기아교 전구세포의 특성을 나타냅니다. 50~70% 정도로 합쳐진(confluent) 마우스 ESL 유래 OPC를 사용하십시오.

세포를 헹구기 위해 배지를 1X PBS로 교체합니다. 전압 개폐성 나트륨 채널 1.2 알파 서브유닛을 도입하기 위해서입니다.

back MAM 나트륨 채널 키트를 사용합니다. back MAM 성분 A 1 mL를 1X PBS 4 mL와 혼합합니다. PBS 린스액을 제거하고 희석된 성분을 첨가합니다.

37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 키트의 설명에 따라 성분 B와 C가 첨가된 OPC 배지로 배경 메모리 제제를 교체합니다. 추가로 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후, 강화 배지를 신선한 OPC 배지로 교체합니다. 다시 24시간 동안 배양한 후, 이 시점에서 ESL 유래 OPC의 스파이킹(spiking) 여부를 분석할 수 있습니다. EBS에서는 GFP 형광이 나타나지 않습니다.

EBS는 최초 재현탁 후 약 30일 동안 강한 GFP 발현을 보이며, 해리 배양 준비 상태가 됩니다. KSR 배지에서 대부분의 세포는 NG2 염색에 대해 면역 양성 반응을 보이며, 이는 GFP 발현과 일치합니다. 하지만 뇌 유래 OPC와 달리, 이러한 MES 세포 유래 OPC는 세포를 0 mV까지 탈분극시켰을 때에도 활동 전위를 생성하지 못했습니다.

바이러스 형질전환을 통해 NAV 1.2 소단위를 도입하면, 이러한 MES 세포 유래 OPC들이 흥분하여 활동 전위를 발생시킵니다. 지금까지 마우스 배아줄기세포를 OPC로 분화시키고 바이러스 형질전환을 통해 스파이킹 OPC를 생성하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 레티노산, 모르핀 및 FGF two를 적절하게 보관하고 항상 신선한 분주액(aliquots)을 사용하며, 사용 후 남은 레티노산은 폐기해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.