세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

전기 융합은 인접한 세포들에 짧은 고전압 전기 펄스를 가하는 과정입니다. 본 영상에서는 수정된 부착법(Adherence Method)을 통해 인비트로(in vitro) 세포 전기 융합 과정을 시연합니다. 실험은 마우스 흑색종 세포인 BF1을 대상으로 수행되었습니다.

실험을 위해 다음 단계를 수행하십시오. 두 개의 별도 배양 플라스크에서 세포를 80% 밀도(confluence)까지 배양합니다. 그 후, 각 스톡 용액 2.1 µL를 각각 첨가합니다.

원심분리 튜브에 담긴 3 mL의 Krebs Hess Buffer에 각각 10 mM의 C-M-F-D-A 또는 CMRA를 첨가합니다. Krebs Hess buffer로 세포를 두 번 세척한 다음, 플라스크에 로딩 용액을 주입합니다. 로딩 용액에는 각각 약 7 µM의 C-M-F-D-A 또는 CMRA가 포함되어 있습니다.

제어된 분위기에서 세포를 30분 동안 배양합니다. 이 1차 배양 동안, 시약들이 세포막을 자유롭게 통과하여 세포질로 들어가며, 여기서 막 투과성 IMP 반응 생성물로 변환됩니다. 1차 배양이 끝나면, 세포를 세척한 후 배양액과 함께 2시간 동안 더 배양합니다.

냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경과 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 세포를 관찰합니다. 여기 파장을 548 nm로 설정하고, CMRA가 로딩된 세포의 형광 이미지를 얻기 위해 적절한 밴드패스 필터를 선택합니다. CFDA가 로딩된 세포의 경우, 여기 파장을 492 nm로 설정하고 녹색 형광 이미지를 위한 밴드패스 필터를 선택합니다. 두 플라스크의 세포 수를 측정하고, 적색 및 녹색 세포를 1:1 비율로 혼합한 뒤 세포 농도를 5 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다.

각 웰의 중앙에 20 µL의 세포 현탁액 방울을 떨어뜨립니다. 24-웰 플레이트 내의 세포들을 조절된 분위기에서 20분 동안 배양하여, 세포들이 웰 표면에 단일층으로 약간 부착되고 세포 간 접촉이 형성되도록 합니다. 세포가 담긴 멀티웰 플레이트를 현미경 스테이지 위에 올립니다.

전극을 웰 바닥에 배치하고 펄스 발생기에 연결합니다. 최적의 전기 융합을 달성하고 세포 생존력을 유지하려면 적절한 전기 펄스 파라미터를 사용해야 합니다. 이러한 파라미터는 세포주에 따라 다르며 예비 실험을 통해 결정되어야 합니다. 배양액을 제거하고 세포를 1 mL ISO omu 인산칼륨 완충액으로 세척한 후, 세포 팽창을 유도하기 위해 350 µL hypos Miller 인산칼륨 완충액으로 세척합니다.

전기 펄스를 가하기 전, 세포를 고삼투압 완충액에 2분 동안 둡니다. 전기 펄스는 세포가 최대 부피에 도달했을 때 가해야 합니다. 즉, 세포가 조절성 부피 감소를 시작하기 전이어야 합니다.

본 실험에서의 감소. 1 Hz에서 100 µs 지속 시간을 가진 8개의 직사각형 펄스 열을 가했습니다. 펄스 인가 후.

10분 후 세포를 10분 동안 그대로 둡니다. 위상차 및 형광 현미경을 사용하여 확산 수율을 측정합니다. 무작위로 선택한 5개의 시야에서 위상차, 적색 및 녹색 형광 이미지 3장을 각각 획득합니다.

Image J 소프트웨어에서 각 이미지 트리플렛(triplet)으로부터 3채널 이미지를 생성하여 이미지의 시각적 품질을 향상시킵니다. 이후 원본 이미지에 배경 제거 및 기본 매개변수 설정을 통한 대비 향상과 같은 전처리 단계가 적용될 수 있습니다. 마지막으로, Image J의 RGB to gray 플러그인을 사용하여 3채널 이미지를 합성합니다. 이렇게 합성된 이미지에서는 세포막과 함께 휴지기 세포질을 확인할 수 있습니다.

따라서 3채널 이미지에서 적색, 녹색 및 이중 형광 세포의 세 가지 유형을 모두 세어 소수의 세포를 쉽게 측정할 수 있습니다. 각 이미지의 전체 세포 수로 이중 형광 세포 수를 나누어 이중 형광 세포의 백분율을 결정하십시오. 융합 효율은 이중 형광 세포의 백분율에 2를 곱한 값으로 정의됩니다.

동일한 색상의 뷰 셀들을 관찰할 때 뷰 셀의 절반이 검출되지 않기 때문입니다.