소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

이 절차의 전반적인 목표는 골격근과 같은 근골격계 연조직에서 성체 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 연조직 생검을 수행한 후, 조직을 제거하고 미세하게 다짐으로써 이루어집니다. 이 절차의 두 번째 단계는 조직을 효소로 분해하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 반복적인 사전 배양(pre plating) 단계를 통해 줄기세포를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 분리된 줄기세포를 확인하는 것입니다. 최종적으로 면역형광법, 현미경 관찰 및 유세포 분석법을 사용하여 세포의 형태학적 및 세포학적 거동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 피츠버그 대학교 정형외과 분자병리학 연구실의 y Lee입니다. 오늘은 골격근과 같은 근골격계 연조직에서 성체 줄기세포를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, Johnny Ward 박사입니다.

저는 피츠버그 대학교 의과대학 정형외과 교수로 재직 중입니다. 저는 Young Lee 박사와 긴밀히 협력하여 골격근 및 표준과 같은 다양한 조직으로부터 줄기세포를 분리하는 절차를 연구해 왔습니다. 저희 연구실에서는 기본적으로 중개 의학 응용을 위한 연구 연구용 줄기세포를 분리하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.

이제 연구를 시작하겠습니다. 줄기세포를 분리할 수 있는 조직으로는 야생형 마우스의 뒷다리 경골 또는 가자미근에서 채취한 힘줄과 골격근을 사용할 수 있습니다. 피부와 뼈의 잔해를 제거한 후, 5% FBS가 첨가된 차가운 HBSS가 담긴 접시에 조직을 넣으십시오.

다음으로, 차가운 HBSS가 담긴 콜라겐 코팅 디쉬에 조직을 각각 놓습니다. 조직 해리와 소화의 기본 절차를 시연하기 위해 골격근 조직을 사용하겠습니다. 미세 가위 또는 메스 날을 사용하여 골격 조직을 거친 슬러리 형태로 잘게 다져 조직의 효소 소화를 준비합니다.

먼저 MIT 조직 슬러리를 각각의 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 4 °C에서 약 3,500 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. HBSS로 재현탁하여 세척액을 제거하고 원심분리를 반복합니다. 상층액을 제거한 후, 미리 데워둔 0.2% collagenase 10 milliliters를 첨가하여 슬러리를 소화시킵니다.

Type 11을 37°C에서 60분 동안 배양하며, 10분마다 튜브를 손으로 흔들어 줍니다. 60분 배양이 완료되면 원심분리한 후, 슬러리를 10 mL의 DYS space solution에 재현탁합니다. 37°C에서 45분 동안 배양하며 10분마다 손으로 흔들어 줍니다. 45분 배양 후 원심분리하고, 슬러리를 10 mL의 0.2% trips in HBSS solution에 재현탁합니다.

일반적으로 37 °C에서 15분에서 20분 동안 배양하며, 10분마다 튜브를 반전시켜 줍니다. 배양이 완료되면, 여기에 나타낸 것과 같이 조직으로부터 충분한 단일 세포가 방출되었을 때 결과 세포들을 원심 분리하고, 세포 펠릿을 5 mL의 증식 배지(PM)에 재현탁합니다. 추출물을 일련의 바늘에 통과시켜 세포 현탁액을 해리시키는데, 18 gauge 바늘로 2회, 23 gauge 바늘로 1회, 마지막으로 27 gauge 바늘로 1회 통과시킵니다.

마지막으로, prepl 기술을 시작하기 위해 세포 추출물을 70 micron 세포 스트레이너에 통과시킵니다. 방금 준비한 세포 추출물을 원심분리하고 펠릿을 증식 배지에 재부유시킵니다. 세포 혼합물 5 mL를 콜라겐 코팅된 T 25 플라스크에 분주하고 PP1으로 표시한 후, 가습된 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 2시간 동안 배양합니다.

2시간 후, 부착되지 않은 세포를 새로운 콜라겐 코팅 T 25 플라스크로 옮기고 PP two로 표시합니다. 이전의 T 25 플라스크(PP one으로 표시됨)에 PM 5 mL를 추가합니다.

두 플라스크를 모두 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, PP two에서 부착되지 않은 세포를 새로운 collagen ENC 코팅 T 25 플라스크로 옮기고 PP three로 표시합니다. PP two로 표시된 플라스크에 증식 배지 5 mL를 첨가합니다.

플라스크를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 인구 집단 PP 6이 될 때까지 24시간마다 이 절차를 반복합니다. 줄기세포 집단이 생성되었습니다.

분리된 PP six 세포는 그 수가 매우 적으므로 FBS가 풍부한 증식 배지에서 유지해야 하며, 배지는 매일 교체해 주어야 합니다. 다만, 이후 1~2주간의 배양 과정 동안 PP six 배양액 내 대부분의 세포가 사멸하게 됩니다.

일반적으로 1~2주의 추가 배양 기간을 거쳐 충분한 수의 건강한 PP six 집단을 생성합니다. 다른 모든 부유 세포 그룹 또한 동일하게 유지하며, 이들이 증식하도록 유도하고 도립 현미경을 사용하여 정기적으로 관찰하십시오. PP one 및 PP two 플라스크에 초기에 부착되는 세포들은 대부분 섬유아세포입니다.

48~96시간의 더 긴 시간 동안 콜라겐 코팅 플라스크에 부착된 세포들입니다. PP3와 PP4는 대부분 근모세포입니다. 근육 위성 세포는 주로 PP5에서 관찰되는 반면, 96시간 이후의 후기 전배양(prepl) 세포인 PP6는 성체 줄기세포로 간주되며 작고 둥글며 투명하게 보입니다.

분리 초기 단계에서, stem cell, antigen one 및 CDC 34와 같은 줄기세포 마커의 발현을 확인하기 위한 면역조직화학 염색을 통해 추가적인 특성 분석이 가능합니다. 지금까지 마우스의 골수에서 줄기세포를 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이 과정을 수행할 때는 모든 단계에서 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

줄기세포를 분리한 후에는, 세포의 줄기세포 특성을 유지하기 위해 해당 세포들을 저밀도로 배양하십시오. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 연구에 행운이 깃들기를 바랍니다. 또한 귀하의 실험에 이 방법을 성공적으로 적용하시길 기원합니다.

감사합니다.