마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서

T 림프구 이동은 림프 기관으로의 호밍, 혈관에서의 유출 및 말초 조직으로의 진입 과정 중에 일어납니다. 이 과정은 T 세포 표면과 다른 세포 간의 접착 상호작용을 포함합니다. 이 현상을 시험관 내(in vitro)에서 조사하기 위해 인간 T 림프구를 분리 및 배양한 후, 접착 단백질이 코팅된 조직 배양 플레이트에 배치합니다.

ICAM 1 및 케모카인 SDF 1입니다. 이후 T 림프구 이동 이미지를 획득하여 분석할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 백신 생물학 및 면역학 센터의 김민수 교수님 연구실의 Craig LeFort입니다.

오늘은 인간 T 림프구의 분리 및 배양, 그리고 이들의 인비트로(in vitro) 이동 분석 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 인테그린의 역할과 T 세포의 이동을 연구하기 위해 이 분석법을 사용합니다. T 세포의 주요 인테그린은 림프구 기능 관련 항원 1(lymphocyte function associated antigen one) 또는 LFA-1입니다.

LFA 1의 특이적 리간드는 ICAM 1과 같은 ICAM 계열입니다. 또한, T세포 이동에는 방향성 신호를 제공하고 인테그린을 활성화하기 위한 케모카인 신호가 필요합니다. 본 실험에서는 T세포 이동을 위한 기질로 인간 ICAM 1 및 CXCL 12 또는 SDF 1을 사용합니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 건강한 기증자로부터 인혈을 채취한 후, 혈액을 상온에서 식힙니다. 이 과정은 약 30분이 소요됩니다.

혈액을 냉각시킨 후, 상온의 polymorph density gradient media 3 mL를 8 mL 원형 바닥 폴리스티렌 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 그 다음, 그 위에 전혈 3 mL를 조심스럽게 첨가합니다. 이때 혼합되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

튜브를 원심분리기에 넣고 500 G에서 45분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 실온에서 말초혈액 단핵구 또는 PBMC가 다른 혈액 성분으로부터 분리됩니다. PBMC 층은 상단에서 첫 번째로 나타나는 흐린 띠 형태로 관찰됩니다.

무균 조건 하에서, 투명한 노란색의 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 그런 다음 P 1000 마이크로 파이펫을 사용하여 PBMC 층을 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다. PBMC를 PBS로 두 번 세척하며, 세포를 500 G에서 5분 동안 원심 분리합니다.

매 세척 후 상층액은 다소 뿌옇게 보일 것입니다. 10% FBS, 1% penicillin streptomycin 및 1 µg/mL phytohemagglutinin(PHA)이 포함된 RPMI 1640 배지 20 mL에 세포를 재현탁하십시오. PHA 존재 하에서의 배양은 T 림프구의 활성화 및 증식을 유도합니다.

피펫을 사용하여 pbmc를 T 75 배양 플라스크로 옮깁니다. 다음으로 37 °C, 5% CO2 조건에서 1~24시간 동안 배양합니다. 이 단계는 플라스크 표면에 부착되는 단핵구(monocytes)를 부유 상태로 남아 있는 림프구(lymphocytes)와 분리하기 위함입니다.

배양 후, 주로 림프구가 포함된 모든 배지를 조심스럽게 제거하여 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 500 G에서 5분 동안 원심분리합니다. RPMI 1640으로 세포 펠렛을 재현탁하고, FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 PHA가 포함된 25 mL의 RPMI 1640이 들어 있는 새로운 T 75 플라스크로 세포를 옮겨 37 °C에서 배양합니다.

24시간 동안 배양한 후, 15~20 mL의 신선한 배지를 추가하고 더 큰 T 175 플라스크로 옮겨야 할 수도 있습니다. 2~3일 동안 배양을 계속합니다. PBMC의 초기 배양이 하룻밤 동안 이루어졌다면, 3일 후 피펫을 사용하여 부유 림프구가 포함된 배지를 제거하고 이를 50 mL 원추형 튜브에 옮긴 후 500 G에서 5분 동안 원심분리합니다.

Reese는 세포 펠렛을 수확하여 25 milliliters의 RPMI 1640이 포함된 새로운 T 75 플라스크로 세포를 옮겼습니다. FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 human IL 2 또는 IL 15를 첨가한 후 세포를 인큐베이터에 넣습니다. T 75 플라스크로 시작하는 경우, 배양액을 확장하여 T 1 75 플라스크로 옮겨야 합니다.

1~2일 후 림프구를 총 4~7일 동안 배양합니다. 이동 분석 전날, 0.17 millimeter 유리 바닥 디쉬에 PBS에 용해된 20 µg/mL의 protein A 또는 G를 코팅하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 디쉬를 PBS로 충분히 세척한 후, ICAM-1 FC와 human SDF-1이 포함된 PBS 용액을 디쉬에 첨가합니다.

분자를 고정하기 위해 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 배양된 세포의 밀도를 측정합니다. 그런 다음 림프구를 PBS로 2회 세척하고, 배양 후 D-glucose가 포함된 L 15 배지 1 mL에 다시 현탁합니다. ICAM-1 FC와 SDF-1로 코팅된 디쉬를 PBS로 충분히 세척한 후, 1 mL의 배지에 포함된 T 림프구를 디쉬로 옮깁니다. 이동 분석에 적절한 세포 밀도를 얻기 위해 디쉬당 약 2~5 $\times$ 10⁵ 개의 세포를 사용해야 합니다.

세포 이동 이미지를 얻으려면, 37°C의 가온 챔버와 같이 온도가 조절되는 환경에서 디쉬를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. NIS elements 소프트웨어의 이미지 설정 메뉴를 엽니다. 라이브 이미징과 이미지 캡처 모드 모두에 대해 2x2 비닝(binning)을 선택합니다.

애플리케이션 메뉴로 이동하여 define, run, experiment를 선택합니다. 이미지 간의 촬영 간격과 총 소요 시간을 설정하십시오. 이미지 캡처 시퀀스의 경우, run 버튼을 눌러 이미지 획득을 시작합니다.

속도, 이동 경로 길이 및 변위와 같은 이동 매개변수는 Image J Auto Quant 또는 veloc와 같은 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 거미줄 도표(spider web plot)를 생성하려면 각 세포와 시간점의 XY 좌표를 수집하고, 각 세포의 공통 시작점을 원점으로 하여 그래프에 투영하십시오. 여기에 제시된 T 림프구는 ICAM 및 SDF-1이 도말된 플레이트에서 배양되었으며, 30분 동안 10초 간격으로 이미징되었습니다.

본 영상은 각 세포의 XYT 좌표를 사용하여 T 림프구가 분당 약 15 µm의 속도로 무작위 이동하는 모습을 보여줍니다. 15개의 세포를 무작위로 선택하여 원점이라는 공통 시작점으로 플롯하였습니다. 스파이더웹 플롯(spiderweb plot)을 비교하면 서로 다른 실험 조건 간의 이동 차이를 시각적으로 빠르게 파악할 수 있습니다.

왼쪽에는 대조군 조건에서의 T 림프구 이동 그래프가, 오른쪽에는 anti LFA-1 리간드 차단 항체가 존재할 때의 T 림프구 이동 그래프가 표시되어 있습니다. 이 데이터는 T 림프구가 ICAM-1 기질 위에서 이동하기 위해 인테그린 LFA-1을 이용한다는 것을 입증합니다. 지금까지 실험 절차를 통해 배양된 인간 T 림프구를 이용한 이동 분석법 수행 방법을 보여드렸습니다.

세포 추적과 이동 분석을 간편하게 하기 위해 ICAM-1이 코팅된 디쉬에 적절한 수의 세포를 분주하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.