Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

이 절차의 전반적인 목적은 두 유전자가 특정 세포 계보의 지정에 있어 기능적으로 중복되는지 여부를 판단하는 것입니다. 이는 먼저 발달 중인 제브라피쉬 배아에 유전자 특이적 morpholino를 주입하여 각 개별 유전자의 기능 상실 표현형을 정의함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 세포 계보의 지정 또는 분화를 정량화하기 위한 분석법을 개발하는 것입니다.

예를 들어, 여기서 보여줄 리포터 어류 계통을 사용하는 방법이 있습니다. 절차의 세 번째 단계는 두 개의 morph FENO를 결합하여 두 유전자의 기능 상실을 동시에 유도하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 이중 넉다운(double knockdown)으로 인해 나타나는 표현형을 평가하는 것입니다.

최종적으로, 계통 리포터를 조사하거나 계통 특이적 마커의 발현을 분석함으로써 특정 계통 세포의 기능 상실 또는 획득을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 마우스 모델에서 녹아웃을 조합하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 검증된 모르포노(morphos)를 단일 실험에서 조합함으로써 어류 모델에서 두 개 또는 세 개의 유전자까지 간단히 타겟팅할 수 있다는 점입니다. 100개 이상의 배아에 주입이 가능하며, 며칠에 걸쳐 표현형을 평가할 수 있습니다.

이 방법은 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 운명을 조절하는 전사 경로를 정의하는 것과 같은 발생생물학 분야에서, 주요 조절 경로는 종종 기능적으로 중복되는 관련 유전자들의 작은 가족군으로 나타납니다. 따라서 이러한 유전자들의 역할은 자매 유전자의 보상 작용으로 인해 마우스 녹아웃 연구만으로는 분명하게 드러나지 않습니다.

이 모델은 제브라피시 배아 발생에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 동일한 유전적 프로그램이 일반적으로 진화 과정 전반에 걸쳐 잘 보존되어 있기 때문에 마우스와 같은 다른 시스템에도 그 결과를 적용할 수 있습니다. 배아에 주입하기 전 미세주입 플레이트를 준비하십시오. 100 밀리미터 페트리 접시의 뒤집힌 뚜껑에 어항 시스템에서 직접 채취한 깨끗한 물인 시스템 워터에 희석된 2% agros 약 12 밀리리터를 붓습니다.

두 개의 현미경 슬라이드를 뚜껑의 양측면에 약 45도 각도로 걸쳐 놓습니다. 아가로스가 응고되면 슬라이드를 뚜껑에서 조심스럽게 당겨, 주입 과정 동안 배아가 놓일 홈을 만듭니다. morpho stock은 주입 전까지 상온에서 1mM 농도로 멸균 증류 탈이온수에 희석하여 보관합니다. morpho stock을 65°C에서 5분 동안 배양하여 완전히 용해되었는지 확인합니다.

스톡 용액을 실온까지 식힙니다. 새로 설계된 각 morpho는 활성과 배아 내성을 경험적으로 검증해야 합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 증류 탈이온수를 사용하여 스톡 morpho를 1~2회 연속 희석하여 1 millimolar, 0.5 millimolar, 0.25 millimolar 및 0.125 millimolar의 작업 농도를 만듭니다.

해부 현미경 하에서, 마이크로 매니퓰레이터에 부착되어 적절히 배치된 보정된 주입 바늘에 흡입을 통해 전면 로딩을 수행합니다. 가장 낮은 농도의 morpho 용액 약 1 µL를 바늘에 로딩합니다. 전이 피펫을 사용하여 수정된 1세포 배아를 마이크로인젝션 플레이트의 트로프(trough)로 옮깁니다.

피펫을 사용하여 플레이트에서 과량의 물을 제거하여 배아가 홈 바닥으로 가라앉게 합니다. 주입 플레이트를 현미경 아래에 배치하고, 바늘을 난막(corion)을 통해 난황 내부로 내립니다. 각 배아에 주입한 후 바늘을 제거하고, 주입 플레이트의 위치를 조정하여 다음 배아에 접근합니다.

주입 방법을 익힐 때, 여기에서 보여주는 것처럼 생체 염색약을 사용하여 세포 내로의 주입 과정을 시각화하는 것이 도움이 될 수 있으며, 배아를 100mm 페트리 접시로 옮겨 시스템 워터에서 28.5°C로 배양하십시오. 바늘에 남아 있는 morpho 용액을 모두 배출하고, 적절한 발달 단계에 있는 다음 배아 집단에 주입하기 위해 그다음으로 높은 농도의 morpho로 채웁니다. 주입된 각 morpho 농도에서 배아의 표현형을 검사하십시오.

각 morpho의 임계 용량은 정의된 신뢰할 수 있는 표현형이 나타나는 가장 낮은 용량입니다. 정확한 임계값을 정의하기 위해 여러 차례의 적정 과정이 필요할 수 있습니다. 이는 서로 다른 두 유전자 사이의 유전적 상호작용을 확인하기 위함입니다.

관심 대상인 두 가지 morpho를 각각의 임계 농도로 혼합하여 준비합니다. 배아가 주입당 총 20 nanograms 이상의 morpho를 견디지 못할 수 있다는 점에 유의하십시오. 이전과 동일한 방식으로 배아에 주입합니다.

실험군과 대조군 간의 주입 부피를 일정하게 유지하십시오. 대조군에는 해부 현미경 하에서 각 morpho만 단독으로 주입한 세트가 포함되어야 합니다. 주입 직후와 하루 동안 수시로 주입된 배아를 관찰하고, 전송 피펫을 사용하여 죽었거나 죽어가는 배아를 제거하십시오. 이러한 배아들은 남은 morpholine의 생존능력을 저하시킬 수 있으므로, 전송 피펫을 이용하여 언제든지 진정시키거나 안락사시킨 배아를 옮겨 제거하십시오.

관찰을 위해 오목 슬라이드로 옮깁니다. 사진 촬영 시, 필요한 경우 날카로운 핀셋을 사용하여 chorion을 제거하십시오.

배아를 3% Methyl cellulose 한 방울에 고정하고, 단일 morphino의 표현형 침투율이 높아진 것이 아니라 morphino 조합에 특이적인 뚜렷한 표현형이 나타나는지 배아를 스크리닝합니다. 여기는 임계값의 morphino를 주입한 여러 야생형 배아의 모습입니다. gata five의 경우, 전구세포가 정중선에서 융합되지 않아 심장이 두 개로 나뉘는 cardio bifida가 전형적인 표현형으로 나타납니다.

화살표로 표시된 GFP 양성 심근세포를 확인하십시오. six morphines의 표현형에는 제대로 루핑(looping)되지 않은 변형된 심장이 포함됩니다. 이러한 배아에서도 GFP 양성 심근세포가 발달합니다.

하지만 여기에서 보여지는 gata five와 gata six 모포의 조합을 주입한 배아들은 심근세포 발달의 완전한 소실을 보입니다. 이는 심근세포가 발달하기 위해서 gata five 또는 gata six 중 하나는 반드시 발현되어야 함을 나타냅니다. 이 두 유전자는 심근세포 분화에 있어 기능적으로 중복됩니다.

이 절차를 수행할 때는, 먼저 morpho의 유효성을 완전히 검증하고, 이 절차를 거친 후 그것들이 단일 표적 유전자의 진정한 knockdown을 나타내는지 최대한 확실히 하는 것이 중요합니다. 포유류에서도 마찬가지로 동일한 유전자가 기능함을 보여주기 위해 조건부 마우스 null 대립유전자를 결합하는 것과 같은 다른 방법들이 수행될 수 있습니다.

영상을 시청한 후, 배아 발생 과정 동안 두 유전자가 기능적으로 중복되는지 확인하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.