랜덤 DNA 라이브러리를 사용하여 뇌관 - 무료 Aptamer 선택

이 절차의 전반적인 목표는 무작위 라이브러리로부터 이번 사례의 표적 단백질인 S 100 B 단백질에 특이적으로 결합하는 abers를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 제한 효소로 라이브러리를 절단하여 측면의 고정 프라이머 서열로부터 무작위 서열을 분리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 무작위 라이브러리 서열을 정제된 S 100 B 단백질에 결합시킨 후 이를 회수하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 하이브리드화 및 결합을 통해 결합된 서열을 고정된 프라이머 서열과 다시 연결하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 결합된 생성물을 전사하여 결합된 후보 aber 풀(pool)의 RT-PCR 재증폭을 가능하게 하는 것이며, 이후 이 선택 절차를 추가로 반복합니다. 최종적으로, 선택된 aber가 S100B 단백질에 특이적으로 결합함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 여기서는 마이크로어레이를 이용한 샌드위치 결합 분석을 수행하며, 기능화된 나노와이어와 15 nanometer 금 나노입자가 결합된 2차 항체 분석 또한 수행합니다. 오늘은 D 서열의 무작위 라이브러리에서 S hundred B 단백질에 결합하는 최적의 서열을 선택하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 암의 조기 진단을 위한 센서 플랫폼 개발을 포함하여 다양한 목적으로 이 절차를 사용하고 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 앞서 설명한 대로 프라이머 프리(PF) DNA 라이브러리를 생성하십시오. 이중 가닥 DNA 라이브러리를 절단한 후 10% 변성 폴리아크릴아마이드 겔로 겔 정제를 수행하면, 5' 인산화된 32 뉴클레오타이드 단편과 5' 인산화된 30 뉴클레오타이드 단편이 생성되며, 이를 각각 32+ 및 30+ 단편으로 지정합니다.

32-플러스 프래그먼트는 3' 말단에 CC 최소 플랭킹 서열이 포함된 30 뉴클레오타이드 랜덤 도메인을 포함하는 반면, 30-플러스 프래그먼트는 30 뉴클레오타이드 랜덤 도메인 서열로만 구성됩니다. aptamer 선택을 위한 PF 라이브러리 DNA 프래그먼트를 준비하려면, 32-플러스 및 30-플러스 프래그먼트 각각을 40 µL의 20 mM tris, HCL pH 7.4에 재현탁합니다. 그 후, 샘플을 인큐베이션하고 85 °C에서 3분 동안 가열합니다.

샘플을 37°C 항온수조에서 3분 동안 냉각하십시오. 다음으로 760 µL의 선택 완충액(selection buffer)을 첨가하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다. 3분 후, 샘플을 실온에서 10분 동안 유지하십시오. 배양이 끝나면, 선택 완충액으로 미리 세척한 nickel NTA agarose beads가 들어 있는 컬럼에 용액을 통과시킵니다.

비특이적 DNA를 제거하기 위해, 컬럼에 결합하지 않은 PF 라이브러리 DNA 단편들을 수집하여 나중에 사용하기 위해 따로 보관하십시오. S 100 B 결합 비즈를 준비하려면, 먼저 니켈 NDA 비즈 400 µL를 마이크로 원심분리기로 3초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하십시오. 그런 다음, 결합 버퍼 400 µL를 넣고 파이펫팅을 5회 부드럽게 수행하여 비즈를 세척하십시오.

그 후 비드를 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 이 과정을 반복합니다. 두 번 세척합니다.

다음으로, 이전에 정제된 히스티딘 태그 단백질을 비드 위로 붓습니다. 여기서는 인간 S 100 칼슘 결합 단백질 B가 사용되었습니다. 3분마다 5회씩, 총 15분 동안 용액을 부드럽게 파이펫팅합니다.

15분 후, 비드를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 마지막으로, 파이펫으로 세 번 부드럽게 섞어 선택 버퍼 400 µL로 비드에 결합된 S 100 B를 세척합니다. 다시 비드를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

S 100 B에 결합된 abers를 선택하기 위해 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번의 최종 세척을 수행합니다. 이전에 따로 보관해 두었던 32 plus 및 30 plus 단편들을 회수합니다. 비드에 결합된 S 100 B에 해당 단편들을 첨가합니다. 그 후 샘플을 15분 동안 배양합니다.

15분 동안 3분마다 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 후, 비드를 짧게 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그다음 800 µL의 선택 버퍼를 사용하여 부드럽게 피펫팅함으로써 S 100 BDNA 복합체를 세척합니다. 이후 비드를 원심분리하여 상층액을 제거합니다. 이 세척 단계를 2회 반복합니다.

S 100을 회수하려면, 20 millimolar tris, HCL pH 7.4 용액 200 microliters를 비드에 추가합니다. 그다음 슬러리를 85 degrees Celsius에서 3분 동안 가열합니다. 배양 후.

비드를 1분 동안 볼텍싱한 후 원심분리하여 가라앉힙니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 더 반복하고 상층액들을 합칩니다.

마지막으로, 선택한 DNA 단편을 정제합니다. PCR 생성물을 동량의 페닐 클로로포름과 isopropyl alcohol로 두 번 추출합니다. 250 millimolar sodium chloride와 2.5배 부피의 100% Ethanol을 넣고 minus 70 degrees Celsius에서 15분 동안 침전시킵니다.

4 °C에서 21,000 g로 15분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거합니다. 펠렛을 75% ethanol로 효율적으로 세척합니다.

4 °C에서 21,000 GS로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 10회의 선택 과정 후, 스피드 진공 농축기로 펠릿을 3분 동안 건조합니다. 결과물인 PCR 증폭 DNA 단편을 Vitrogen Core에서 얻은 PCR 2.1 topo vector에 클로닝합니다.

그 다음, 선택된 N 30 cc 및 N 30 단편 각각에 대해 M 13 forward primer를 사용하여 40~50개의 단일 콜로니를 시퀀싱합니다. infomax vector NTI 소프트웨어를 사용하여 선택된 서열들을 정렬합니다. 그런 다음, 정렬 결과를 바탕으로 컨센서스 서열을 결정합니다.

합의 서열이 확인되면, 서면 프로토콜에 설명된 대로 합의 올리고뉴클레오타이드를 구매하십시오. 5' 말단에 Amin C6 작용기가 결합된 상태로 합성된 첫 번째 압타머를 프린팅 버퍼에 현탁하여 최종 농도가 15 µM이 되도록 합니다. 그 후, Apogen Discoveries 마이크로그리드 어레이를 사용하여 코드링크(code link) 활성화 슬라이드 위에 압타머 용액을 스폿팅합니다.

코드 링크에 권장된 프로토콜을 따르십시오. 슬라이드당 12개의 어레이가 포함되도록 인쇄하십시오. 2x8 형식을 사용하십시오.

하이브리다이제이션을 위한 마이크로어레이 하이브리다이제이션 카세트입니다. S 100 B 단백질을 70 µL의 PBS에 희석하여 적절한 농도로 만듭니다. 그 후, 해당 용액을 마이크로어레이 카세트의 웰에 분주합니다.

증발을 방지하기 위해 뉴클레아제 프리 접착 밀봉 호일(nuclease free adhesive ceiling foil)을 사용하여 마이크로어레이 카세트를 밀봉하십시오. 단백질이 코드 링크에 프린팅된 abers에 결합할 수 있도록 실온에서 1시간 동안 개별적으로 인큐베이션하십시오.

카세트의 웰을 5 mM 염화마그네슘이 포함된 PBS 또는 PBSM으로 3회 세척합니다. 다음으로, 형광 표지된 2차 항체를 PBSM 70 µL에 희석하여 0.125 µM 농도로 만듭니다. 혼합물을 85 °C에서 3분 동안 가열합니다.

그 다음 표지된 ABERS를 얼음 위에서 냉각시킵니다. 3분 동안 마이크로어레이 카세트의 웰에 abers를 도포합니다. 다시 접착성 호일로 카세트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

다시 한번 개별적으로 수행합니다. 세척 후 PBSM으로 웰을 3회 세척하십시오. 카세트를 분리하고 슬라이드 전체를 PBSM으로 헹굽니다.

그 다음 원심분리를 통해 슬라이드를 완전히 건조시킵니다. 마지막으로, Packard Biosciences 스캔 어레이를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다. $\gamma$ $\text{P}^{32}$ $\text{ATP}$ 5' 말단 표지 앱타머의 S100B 단백질에 대한 4,000 XL 결합도를 측정하고, $\text{K}_D$ 결정을 위해 이를 농도에 따라 도식화하였습니다.

약 7라운드의 선택 과정 후 대표적인 Kd 값은 일반적으로 10⁻⁷ M 범위에 해당합니다. 5' 말단에 biotin이 결합된 첫 번째 aptamer를 code link microarray에 결합시켰으며, 정제된 S100B 단백질을 첫 번째 aptamer에 결합시킨 후, IRDye 800CW로 표지된 두 번째 aptamer를 S100B-첫 번째 aptamer 복합체에 결합시켰습니다.

형광은 스캔 어레이 스캐너를 사용하여 정량화되었습니다. 중간 행은 위아래 행의 KD 분석에서 가산적 결합으로 특징지어지는 샌드위치 결합을 보여줍니다. 5' 말단 티올 유도체화된 첫 번째 항체들에 대해서는 샌드위치 결합이 나타나지 않았으며, 표준 티올 화학법을 사용하여 금 나노와이어에 결합시켰습니다.

두 번째 항체는 동일한 방식으로 50 nM의 금 나노입자(gold nps)에 결합되었습니다. 정제된 S 100 B 단백질을 먼저 유도체화된 나노와이어의 첫 번째 앱타머에 결합시킨 후, 50 nM의 금 나노입자가 결합된 두 번째 앱타머를 첫 번째 앱타머-나노와이어-S 100 B 복합체에 순차적으로 결합시켰습니다. 결합된 샌드위치 복합체는 FE-SEM을 사용하여 시각화하였습니다.

S 100 B 단백질 대신 HTRA one 단백질을 사용하여 수행한 결합 분석의 음성 대조군을 확인할 수 있습니다. 이 절차에서 가장 중요한 점 중 하나는 프라이머가 없는 방식을 사용한다는 것입니다. 이를 통해 서열 자체가 랜덤 영역을 압도하여 위양성 및 위음성을 유발할 수 있는 고정 서열을 배제할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 각 역전사 반응 전에 DNA 템플릿이 완전히 제거되었는지 확인하는 것이 중요하며, 각 재증폭 후 특정 RT-PCR 산물을 주의 깊게 분리해야 합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.