의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis과 인간

다음 실험의 전반적인 목적은 내부로 유입된 박테리아인 RIA Meningitidis와 세포골격 단백질인 Alpha Actinin의 공국소화 수준을 평가하는 것입니다. 이를 위해 배양된 인간 뇌 미세혈관 세포를 하룻밤 동안 배양한 박테리아로 3시간에서 8시간 동안 감염시켜 박테리아가 표적 세포 내로 진입하도록 합니다. 두 번째 단계로, 세포 내 박테리아가 포함된 세포를 세척, 고정 및 투과화하여, 내부로 유입된 박테리아와 세포 내 alpha actinin의 면역 염색을 위한 감염 배양 상태를 준비합니다.

공초점 이미지 촬영 및 공국소화(colocalization) 소프트웨어를 적용한 후, 세포 내 공국소화 이미지를 관찰할 수 있으며, 공초점 현미경 시각화 및 정량적 공국소화 분석을 통해 Meninga Croci를 발현하는 OPC와 막 단백질이 세포 내 alpha actinin과 특이적으로 상호작용한다는 정량적 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, Bri 대학교 세포분자의학과의 Professor Mata TI 연구실 소속 Isel Maria입니다. 오늘은 세포 내 박테리아와 세포골격 단백질의 공국소화 비율 및 수준을 추정하는 절차를 보여드리겠습니다.

당사 연구실에서는 자가 막 단백질 OPC를 발현하는 mycelium meningitis와 세포골격 단백질 alpha actin의 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이 작업은 적절한 안전 설비를 갖춘 실험실에서 수행되어야 합니다.

면역 염색 절차 이틀 전에 목적하는 세균 균주를 뇌심장 침출액(brain heart infusion) 배지에 접종합니다. 10% 가열 말 혈액이 첨가된 한천 배지를 면역 염색 전날 37 °C, 5% CO2 환경에서 하룻밤 동안 배양합니다. 10 µL 배양 루프를 사용하여 하룻밤 동안 배양한 세균 배양액의 현탁액을 만듭니다.

2 mL의 PBSB에서 현탁액을 실온에 5분 동안 방치하여 거대 세균 응집체가 가라앉도록 합니다. 그다음, 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 현탁액의 상층액 1 mL를 멸균 튜브로 옮깁니다. 20 µL의 세균 현탁액이 들어있는 두 개의 바이알에 1% SDS 0.1 M 수산화나트륨 1 mL를 첨가하고 튜브를 반전시켜 혼합함으로써 세균을 용해시킵니다. 이는 세균 수를 추정하기 위함입니다.

용액의 흡광도를 측정하여 핵산 함량을 측정합니다. 216 nm에서 인간 뇌 미세혈관 내피세포를 감염시키기 위해 감염 배지 내 박테리아 현탁액을 필요한 밀도로 조정합니다. 면역 염색 2일 전에, 12-웰 플레이트의 웰에 16 mm 유리 커버스립을 배치하고 HBME cells를 커버스립 위에 50% Confluence로 파종합니다. 다음 날까지 37 °C, 5% CO2 분위기에서 하룻밤 동안 배양합니다.

실험실에서 갓 준비한 박테리아 현탁액으로 세포를 감염시킵니다. 일반적으로 표적 세포당 200에서 300 colony forming units의 감염 비율을 사용합니다. 감염 기간이 끝나면 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 3시간에서 8시간 동안 배양합니다.

PBS로 세포를 3회 세척하고, 2% paraformaldehyde 500 µL를 사용하여 상온에서 30~45분 동안 고정합니다. paraformaldehyde를 세척해 낸 후, PBS에 희석한 0.1% Triton X 100에서 10분간 배양하여 paraformaldehyde로 고정된 세포를 투과화합니다. 마지막으로 샘플을 PBS로 3회 세척하고 제시된 바와 같이 면역 염색을 진행합니다. 이어서 세포 내 박테리아와 actinin에 대한 염색을 동시에 수행할 수 있습니다.

12웰 플레이트에서 투과화된 세포가 포함된 커버슬립을 3% B-S-A-P-B-S-T 500 µL로 30분에서 60분 동안 블로킹합니다. 실온에서 PBS로 세척한 후, 각 커버슬립을 12웰 플레이트의 새로운 건조한 웰로 옮기고 박테리아 및 alpha actinin에 대한 1차 항체를 동시에 처리합니다. 커버슬립 표면을 덮을 수 있도록 주의해서 첨가한다면 커버슬립당 80~100 µL의 항체로 충분하며, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 웰에 PBS 200 µL를 첨가하고 커버슬립을 들어 올려 PBS 500 µL가 들어 있는 새로운 웰로 옮깁니다. 5분 후, 피펫팅으로 PBS를 제거한 다음 신선한 PBS를 첨가합니다. 이 과정을 두 번 반복하고 커버슬립을 새로운 건조한 웰로 옮깁니다.

다음으로, 1% B-S-A-P-B-S-T에 희석하고 서로 다른 형광색소가 접합된 적절한 2차 항체를 첨가합니다. 암실 상태의 상온에서 1시간 동안 배양하고, 배양이 끝나면 이전 단계와 같이 세척합니다. 그 다음, 암실 상태의 상온에서 5분 동안 DPI를 사용하여 DNA를 대조 염색합니다. 이 배양이 끝나면 커버슬립을 PBS로 한 번 세척한 후, 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨려 마운팅합니다. 마운팅된 커버슬립은 관찰 전까지 암소에 보관해야 합니다. 도립 에피 형광 현미경에 부착된 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 면역 표지된 샘플을 관찰하고 이미지를 캡처합니다.

CLSM 절차를 시작하려면 대물렌즈에 침액 한 방울을 떨어뜨리고 검체 슬라이드 커버를 덮은 다음, 현미경 스테이지 위에 올립니다. 현미경을 시각 모드로 설정하고 접안렌즈를 통해 관심 영역을 찾으면 Leica 소프트웨어를 사용할 준비가 된 것입니다. XY z 획득 모드를 선택하십시오. 공국소화(colocalization) 연구를 위해 512 by 512 포맷을 선택하십시오.

해상도가 높을수록 이미지가 더 정확해집니다. 그런 다음 양방향 X 모드(bidirectional X mode)를 선택하십시오. 이는 스캔 속도를 높여 광퇴색(photo bleaching)을 줄이는 데 도움이 됩니다. 순차 스캔 설정을 구성하십시오.

SEC 기능을 클릭한 다음 라인을 선택하십시오. 2차 항체에 접합된 형광색소에 따라 레이저 빔을 선택하십시오. DPI의 경우 405 nm, Alexa Fluor 488의 경우 488 nm, 그리고 561 nm를 선택하십시오.

Trixy를 위해 광전자 증배관(photomultiplier tube) 1, 2, 3을 각각 활성화합니다. Z-stack 또는 시리즈의 상단과 하단을 설정합니다. 다음으로, Z-step 크기를 0.2 micrometers로 설정합니다.

RIA Mencius는 diplo occus이며, 각 caucus의 직경이 약 0.5 micrometers이므로, Z 단계 크기를 0.2 micrometers로 설정하면 각 caucus를 최소 두 번 스캔할 확률이 높아집니다. 시작 버튼을 클릭하여 라인 평균값을 3으로 선택함으로써 신호 대 잡음비를 향상시켜 최종 스캔 파라미터를 설정하십시오. 서로 다른 파장에서 순차적으로 스캔하고, 각 채널에 대해 between lines 모드를 사용하여 서로 다른 chromophore 간의 크로스토크(crosstalk)를 제거함으로써 이중 또는 삼중 염색 이미지를 얻습니다.

두 형광색소의 공국소화(colocalization) 여부를 확인하려면, 오버레이(overlay) 기능을 선택하여 선택한 채널들을 하나의 이미지로 병합하십시오. 예를 들어, Alexa 488과 trissy Fluor Chromes가 모두 공국소화될 경우 오버레이된 이미지에 노란색이 나타납니다. 잠재적인 공국소화를 시각화하기 위해 2D 재구성이 필요한 경우, 최대 투영(maximum projection) 기능을 사용하여 Z-스택(Z-stack) 또는 시리즈를 컴파일하십시오. Z-스택 또는 시리즈를 획득한 후, 데이터를 처리하여 다양한 요소들의 세포 내 국소화를 시각화하기 위한 직교 이미지(orthogonal image)를 얻으십시오.

공국소화(colocalization)의 정량 분석은 IMP에서 제공하는 Vol City 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 먼저 CLSM 이미지로 라이브러리를 생성한 다음, 상단 바의 이미지에서 extended focus를 선택하십시오. 이 도구는 분석할 2D 이미지로 Z-stack을 결합합니다.

이제 COLOCALIZATION 도구를 선택하십시오. 분석할 두 채널은 동일한 색 깊이를 가져야 합니다. 정량 분석을 수행할 영역을 선택하십시오.

배경을 제거하기 위해 임계값을 설정합니다. 'generate colocalization'을 선택하여 공국소화 결과물을 생성합니다. 이전에 선택한 관심 영역(ROI)에 대한 공국소화 통계가 생성됩니다.

다음으로, Mander의 계수인 R과 ny를 선택하십시오. 마지막으로, 데이터 제시를 위해 통계 값을 Excel 문서로 내보냅니다. 여기에는 meningococcus에 8시간 동안 감염된 인간 뇌 혈관 내피 세포의 대표적인 공초점 이미징 결과가 나타나 있습니다. 박테리아의 위치는 빨간색으로 표시됩니다.

alpha actinin의 위치는 녹색으로 표시되어 있으며, 화살표는 박테리아 주변으로 alpha actinin이 고도로 축적된 것으로 보이는 영역을 나타냅니다. 이 중첩 이미지에서 노란색과 오렌지색으로 나타나는 여러 영역은 meninga occi와 alpha actinin 사이의 공국소화(colocalization)를 시사합니다. 다음 이미지에서 감염된 H-B-M-E-C 단층의 광학적 절편 분석 결과, 세포 기저부에 위치한 세포 내 박테리아 주변에서 공국소화가 확인됩니다.

감염된 H-B-M-E-C 단층의 3차원 이미지를 처리했을 때, 정단면의 사선 뷰에서는 빨간색 화살표로 표시된 빨간색으로 염색된 Durant 박테리아가 나타나며, 노란색 화살표로 표시된 여러 박테리아는 내피 세포의 기저면 쪽으로 위치해 있습니다. 뚜렷한 오렌지색 또는 노란색의 기저부 위치는 이 endon XZ 단면에서 더 명확하게 확인할 수 있습니다. internalized 박테리아와 menton 또는 actin을 함께 라벨링한 afar, actinin 실험과 대조적으로, H-B-M-E-C 세포에서는 actin과의 국소화는 간헐적으로 나타나지만 fermenting과의 국소화는 드물게 나타납니다.

이전 실험에서 관찰된 바와 같이, Retin은 흰색 화살표로 표시된 여러 내부화된 박테리아 주변에 응집되어 있었습니다. 또한 상대적 중첩도를 구하기 위해 데이터를 분석했습니다. Manda에 따르면, 공국소화의 실제 정도(IE), 즉 전체 픽셀 수 대비 공국소화된 픽셀 수를 나타내는 계수 R을 통해 OPC 발현 수막구균에 감염된 H-B-M-E-C 내 alpha actinin, menting 및 actin 전체에 대한 NY 값을 분석한 결과, 수막구균 내 rein의 중첩도가 25%보다 높게 나타났습니다.

계수 Y는 덜 풍부한 meninga cocoa 신호가 발생할 때마다 더 풍부한 rein 신호가 나타나는 빈도를 측정한 값입니다. 이 측정값은 내재화된 meninga cockeye 주변에서 alpha actinin이 매우 높은 수준으로 발생함을 보여줍니다. 본 실험을 통해 내재화된 박테리아와 세포골격 요소의 공존을 시각화하고 정량화하는 방법을 보여드리겠습니다.

구조의 무결성을 유지하고 높은 배경 신호를 방지하기 위해 고정 및 면역 염색 프로토콜을 엄격히 준수하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.