기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

기계적 자극에 대한 세포의 실시간 반응 연구는 우선 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포를 유리 바닥 배양 접시에서 24시간 동안 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 AFM 팁을 비오틴화된 피브로넥틴으로 코팅하는 것입니다. 그런 다음, 기능화된 AFM 팁을 세포 표면에 접촉시켜 AFM 팁 주변에 강력한 국소 접착이 형성되도록 하며, 이를 통해 피브로넥틴이 코팅된 팁과 세포 사이의 매트릭스-인테그린-액틴 연결을 통해 액틴 세포골격을 직접 조작할 수 있게 합니다.

마지막 단계는 AFM 팁을 제어된 상향 이동시켜 살아있는 세포를 기계적으로 자극함으로써, 강한 초점 접착(focal adhesion)을 파괴하지 않고 세포 접촉 지점에 수직력을 가하는 것입니다. 결과적으로, 실시간 형광 광학 이미징으로 기록된 바와 같이, 세포는 기질에 대한 부착을 강화하고 액틴 세포골격 재구성을 유도함으로써 기계적 자극에 반응하는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 Texas A&M Health Science Center 시스템 생물학 및 중개 의학과의 조교수 Andrea Trake입니다.

안녕하세요, 저는 Texas A&M Health Science Center 시스템 생물학 및 중개 의학과의 박사후 연구원 Sum Lim입니다. 오늘은 기계적 자극에 따른 세포의 적응적 리모델링을 연구하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 연구실에서는 살아있는 혈관 평활근 세포의 실시간 세포골격 재구성(cytoskeletal remodeling)을 조사하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 이러한 연구를 위해 CSU 22 Yokogawa 스캐닝 헤드가 결합된 전반사 형광(total internal reflection fluorescence, TIRF) 장치가 장착된 Olympus IX 81 도립 현미경이 사용됩니다.

Bio scope SZ 원자간력 현미경이 도립 광학 현미경 상단에 장착되어 있습니다. 전체 시스템은 연구용 광학 테이블 위에 설치되었으며, 이에 대한 상세한 내용은 이전에 설명된 바 있습니다. 이 통합 현미경은 두 대의 quant EM 전자 증배 전하 결합 소자 또는 E-M-C-C-D 카메라를 사용합니다.

하나는 터프 이미징(turf imaging)용이고, 다른 하나는 공초점 이미징(confocal imaging)용입니다. 스피닝 디스크 스캐너, 외부 필터 휠, 그리고 E-M-C-C-D 카메라로 구성된 공초점 어셈블리는 진동 감쇠에 필요한 실리콘 패드 위에 놓인 알루미늄 베이스 플레이트에 장착되어 있습니다. 공초점 어셈블리 전체는 나사형 칼라가 있는 플랜지를 통해 현미경과 연결됩니다.

따라서 원자 힘 현미경(AFM) 또는 FM 측정 중에 어셈블리를 현미경에서 분리하여 회전 디스크 스캐너로 인한 진동을 방지할 수 있습니다. 아르곤 크립톤 레이저가 turf 및 공초점 이미징 모드 모두의 여기원으로 사용됩니다. 레이저는 두 개의 광섬유 중 하나에 연결될 수 있으며, 이 광섬유는 레이저를 turf 부착물 또는 공초점 스캐닝 헤드로 전달합니다.

두 대의 컴퓨터가 시스템을 제어합니다. 한 대는 광학 이미징을 제어하는 slide book 소프트웨어를 사용하며, 다른 한 대는 AFM을 제어하는 nano scope 소프트웨어를 사용합니다. 기계적 자극 실험 24시간 전에, 특정 단백질을 표적으로 하는 GFP 컨스트럭트를 발현하는 살아있는 세포를 유리 바닥 세포 배양 접시에 분주합니다. 실험 당일에는 세포 배양 배지를 phenol red free 배지로 교체합니다.

a FM 실험은 노이즈에 매우 민감하므로, 노이즈를 최소화하기 위해 실험 중에 말을 하거나 광학 테이블 또는 현미경을 만지는 것을 피하십시오. a FM 측정 시에는 스피닝 디스크 공초점 현미경을 현미경에서 분리하십시오. 실험은 마그네틱 칼라를 사용하여 세포 배양 접시를 마그네틱 현미경 스테이지에 고정하고 a FM 스테이지 위에 장착하는 것으로 시작합니다.

A FM 프로브의 V자형 캔틸레버에는 2 µm 크기의 비오틴화 유리 비드가 맞춤 제작되어 있습니다. 캔틸레버는 현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있습니다. 비드는 캔틸레버의 맨 끝부분에 접착되어 있으며, 이 위치에 코팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 도포해야 합니다.

실험을 위한 FM 프로브를 준비하려면, 먼저 팁을 유리 홀더에 장착한 다음 유리 홀더를 테이블 마운트에 올려 팁을 코팅합니다. 팁 끝부분에 10 µL의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS를 조심스럽게 떨어뜨려 팁을 세척한 후, 킴와이프로 팁을 건조시킵니다. 1 mg/mL 농도의 DPBS로 세척한 후 이 과정을 5회 반복합니다.

용액 내의 Avid. 팁 끝에 한 방울씩 떨어뜨립니다. Avid 코팅 후 팁을 5분 동안 배양합니다.

팁을 DPBS로 5회 더 세척합니다. 그다음 1 mg/mL 농도의 용액을 팁에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분 동안 배양하여, avadon에 비오틴화된 피브로넥틴(biotinylated fibronectin)을 교차 결합시킵니다.

마지막으로, 팁 끝에 마지막 한 방울이 남도록 DPBS로 팁을 다시 다섯 번 세척하십시오. 팁 준비가 완료되면, 팁을 AFM 스캐너에 장착하십시오. AFM 팁을 장착한 후, 홀더 주변에 보호용 실리콘 스커트를 배치하십시오.

그런 다음 비디오 관찰을 위해 현미경을 설정합니다. 이어서 FM 팁을 시야의 중심에 맞춥니다. 레이저 빔을 캔틸레버의 맨 끝부분에 위치시켜 광학 레버를 설정합니다.

그런 다음, 단일 세포 이미징에 적합한 고배율 대물렌즈로 교체하십시오. 이어서 기계적 자극을 가할 세포를 시야 내로 이동시키고, AFM 팁이 세포 표면에 접촉할 위치를 선택하십시오. 마지막으로, AFM 팁을 내려 해당 세포에 접촉시키십시오.

팁을 세포에 접촉시킨 후, 약 20분 동안 기다립니다. 이를 통해 세포 표면의 FM 접촉 지점에 강력한 국소 접착(focal adhesion)이 형성되도록 합니다. 대기 시간이 지난 후, 기계적 자극 실험을 준비하기 위한 기계적 자극 절차를 시작할 수 있습니다.

형광 세포 이미징을 위해 비디오 카메라에서 E-M-C-C-D 카메라로 전환하십시오. 그런 다음 휴지 상태인 세포의 초기 이미지를 획득하십시오. 세포 전체의 액틴 세포골격을 시각화하기 위해 스피닝 디스크 및 공초점 현미경을 사용하십시오.

반대로, 세포를 자극하기 위해 turf를 사용하여 국소 접착물을 시각화하십시오. 캔틸레버를 사용하여 3~5분마다 불연속적인 단계로 정밀하게 제어된 상향 이동을 가합니다. A FM 데이터를 수집하는 동안, 연산자는 Z piso 위치의 전압을 지속적으로 모니터링하여 수직 폴의 적절한 타이밍을 결정하는 것이 중요합니다.

Slide Book 소프트웨어를 사용하여 각 수직 견인 후 세포의 공초점 또는 turf 이미지를 FM 데이터 획득과 동시에 기록하십시오. 자극 실험이 완료되면 AFM 팁을 세포에서 제거하십시오. Actin MRFP와 vcul이 형질전환된 혈관 평활근 세포입니다.

FM을 사용하여 정단 세포 표면의 GFP를 촬영하였습니다. 동일한 세포의 기저 세포 표면은 turf를 사용하여 촬영하였습니다. 여기 두 이미지를 중첩시킨 모습입니다.

동일한 세포의 이미지 또한 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 세포 전체 영역에서 획득하였으며, 이를 3D 스택의 최대 투영 영상으로 나타내었습니다. A FM 이미지와 스피닝 디스크 공초점 이미지 사이의 우수한 중첩 양상을 확인할 수 있습니다. actin MRFP가 형질전환된 혈관 평활근 세포를 A FM으로 기계적 자극을 주었으며, 스피닝 디스크 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하였습니다.

이러한 오차들은 FM 자극 시 현저한 재구성이 일어나는 액틴 섬유(actin fibers)를 나타냅니다. 기계적 자극으로 인해 일부 액틴 섬유는 중합되고 다른 섬유들은 탈중합되며, 또 다른 액틴 섬유들은 서로 묶입니다. 이러한 액틴 재구성으로 인해, EFM을 사용하여 살아있는 세포 배양물을 기계적으로 자극하는 동시에 광학 이미징 방법을 통해 세포질(CY) 재배열을 기록하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 FM 실험은 노이즈에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.