이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

이 영상에서는 일관된 라만 산란 신호를 가진 생물학적 구조와 관련된 두 가지 라만 공명(ramen resonances)의 차분 영상(differential imaging)을 수행하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 동기화된 세 개의 단펄스 레이저를 시간적, 공간적으로 중첩시킵니다. 그 후 중첩된 펄스를 표준 도립 현미경으로 보내 미세 객체로부터 일관된 라만 신호를 생성합니다.

생성된 서로 다른 라만 신호를 비교하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 신호를 이미지로 변환합니다. 결과에 따르면, 이중 공명 및 단일 공명 라만 신호에서 얻은 이미지 간의 차이가 약한 라만 신호에 대해 향상된 민감도를 제공하는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 바이오포토닉스 센터의 Tyler Weeks입니다.

저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 바이오 포토닉스 센터 및 내과 전문의인 Thomas ER입니다. 오늘은 화학적으로 특이적인 세포 이미지를 생성하기 위해 이중 공명 일관성 안티-스토크스 라만 산란(doubly resonant coherent anti-stokes raman scattering)을 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 일관성 안티-스토크스 라만 분광법만으로는 직접 검출하기에 너무 약한 분자들의 신호를 검출하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. CARS 및 Dr-CARS 신호를 동시에 생성하려면 튜닝 가능하고 동기화된 세 개의 단펄스 레이저 광원이 필요합니다. 이러한 동기화된 펄스를 얻기 위해, 먼저 출력 10 W, 고정 파장 1064 nm, 고정 펄스 길이 7 ps 및 고정 반복률 76 MHz의 단일 단펄스 레이저에서 시작합니다.

일련의 반파장판과 편광 빔 분할 큐브를 사용하여 빔을 세 부분으로 분할합니다. 반파장판과 편광 빔 분할 큐브를 결합하면 빔의 방향을 바꾸지 않고도 각 성분의 출력량을 조절할 수 있습니다. 일반적으로 두 개의 빔은 각각 약 4.5 watts로 조정하며, 세 번째 빔에 나머지 1 watt가 포함되도록 합니다.

그 후 두 개의 고출력 빔은 두 개의 독립적인 광 파라메트릭 발진기(OPO)로 유도됩니다. OPO는 서로 다른 주파수 생성을 이용하여 고에너지 광자를 서로 다른 파장을 가진 두 개의 저에너지 광자로 변환합니다. 이 효과를 구현하는 데 사용되는 결정의 온도를 조절함으로써, 생성된 광자의 파장을 0.1 nanometers 이내로 제어할 수 있습니다.

이러한 신호들의 주파수를 두 배로 높임으로써, 1064 nanometers의 고정 파장을 가진 레이저를 동일한 1064 nanometer 광원을 사용하는 두 개의 별도 OPO에 펌핑하여 780 nanometers에서 910 nanometers 사이의 어느 지점으로든 튜닝 가능한 레이저 빔으로 변환할 수 있습니다. 이를 통해 원래의 펌프 레이저와 자동으로 동기화되는 두 개의 독립적으로 튜닝 가능한 레이저 광원을 얻게 됩니다. 1064 nanometer 펌프 레이저에서 나오는 세 번째 빔은 유전 거울의 조합을 통해 OPO 주변으로 유도되어, 나중에 세 빔이 모두 다시 결합될 수 있도록 합니다.

일관된 라만 신호 광자를 효율적으로 생성하기 위해서는 결합된 펄스들이 시간적 및 공간적으로 모두 중첩되어야 합니다. OPO는 각 레이저 펄스가 결정을 여러 번 통과할 수 있도록 하는 링 캐비티를 포함하고 있으므로, OPO를 통해 전송된 빔은 추가 거리를 이동하게 되어 원래의 펌프 빔에 비해 상당한 지연이 발생합니다. 이 거리는 세 번째 빔을 통해 보정되어야 하며, 다이크로익 미러를 사용하여 빔들을 재결합하기 전에 이 빔이 다른 두 빔과 동일한 거리를 이동하도록 유도하는 추가 미러를 도입함으로써 경로 길이를 미세하게 조정할 수 있습니다. 각 빔은 조절 가능한 지연 스테이지를 통과하며, 이를 통해 서로 다른 레이저 펄스들의 시간적 중첩을 조정할 수 있습니다.

각 빔의 레이저 출력을 독립적으로 조절하기 위해 반파장판 세트와 편광 빔 분할기 큐브를 각 빔에 추가합니다. 다이크로익 미러를 사용하여 먼저 두 OPO의 빔을 결합한 다음 1064 nanometer 빔을 결합하며, 이때 빔들이 공간상에서 정밀하게 겹치도록 주의해야 합니다. 이는 다이크로익 미러에서 수 cm 이내의 빔 중첩 상태와 약 1 meter 거리에서의 중첩 상태를 비교함으로써 확인할 수 있습니다.

평균 출력값이 높은 레이저 빔에 노출되면 시료가 손상될 수 있으므로, 결합된 세 개의 빔은 펄스 피커(pulse picker) 역할을 하는 전기 광학 변조기를 통과합니다. 이를 통해 시료에 도달하는 펄스의 반복률을 조절함으로써 평균 출력을 조정할 수 있습니다. 그 후, 결합된 레이저 빔은 높은 개구수(numerical aperture 또는 na)를 가진 대물렌즈가 장착된 도립 현미경으로 결합됩니다. 높은 NA 대물렌즈에 의해 형성된 조밀한 초점은 미세한 길이 스케일에서 코히런트 라만 신호를 가장 효율적으로 생성할 수 있게 합니다.

현미경의 대물렌즈는 X, Y, Z 피조 스테이지(pizo stage)에 장착되어 있어, 상용 빔 스캐닝 공초점 현미경과 유사하게 빔을 시료 전체에 래스터 스캐닝하여 이미지를 얻을 수 있습니다. 이제 CARS 및 DRFWM 신호를 생성하는 방법을 살펴보겠습니다. 시료에서 세 개의 짧은 펄스 레이저 빔이 상호작용하면, 두 개의 레이저가 다양하게 조합되어 발생하는 CARS와 같은 여러 사파동 혼합(four wave mixing) 신호를 비롯하여, 세 가지 레이저가 모두 조합된 3색 CARS 및 DR CARS 신호가 생성됩니다. 신호들의 파장이 서로 매우 가까울 경우, 분석을 위해 이를 분리하는 것이 어려울 수 있습니다.

이러한 이유로, 신호는 단색화 장치 또는 밴드 패스 필터 역할도 겸하는 이미징 분광계로 전달되어 서로 다른 파장의 신호를 공간적으로 분리합니다. 분광계 내부에 전자적으로 구동되는 플립 미러가 내려간 상태에서는 신호가 후면 조사형 딥 디플리션 전하 결합 소자 또는 CCD 카메라로 전달됩니다. 이 카메라는 전체 신호 범위에 걸친 분광 정보를 제공하며, 이를 통해 다양한 코히런트 로빈 신호를 식별 및 최적화하여 이미징할 신호를 선택할 수 있습니다. 공급업체에서 제공한 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 분광계 내의 격자를 회전시키면, 관심 있는 피크를 CCD 카메라의 중심에 맞출 수 있습니다.

그다음 플립 미러의 위치를 변경하여 신호를 단일 광자 계수 아발란체 광다이오드(APD) 또는 PD가 연결된 두 번째 출력 포트로 리다이렉트합니다. 대물렌즈를 래스터 스캔하고, APD에서 기록된 신호를 사용하여 데이터 획득 소프트웨어로 각 픽셀의 광자 계수율을 표시함으로써 이미지를 생성합니다. 이 이미징 절차를 원하는 각 코히어런트 라만 신호에 대해 반복하여, 사후 처리 과정에서 신호들을 비교할 수 있도록 합니다.

이제 명확하고 재현 가능한 이미지를 얻기 위해 샘플을 적절하게 준비하는 방법을 살펴보겠습니다. 샘플 준비 시 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 샘플은 일반적으로 두께가 약 150 micron인 유리 커버슬립 위에 준비합니다.

이 커버 슬립은 본 실험에 사용되는 고 NA 수침 또는 유침 대물렌즈로 고해상도 이미징을 수행할 수 있을 만큼 충분히 얇습니다. 일반적인 시료 준비 과정을 보여드리기 위해, 현미경 슬라이드에 고정된 약 20 micron 두께의 마우스 근육 조직 절편을 준비합니다. 여기에 5 molar 중수소화 포도당 용액 20 microliter 한 방울을 시료에 첨가합니다.

중수소화 포도당 용액은 독특하고 강력한 라만 배경 시그니처를 제공합니다. 샘플 위에 유리 커버슬립을 얹고 매니큐어를 사용하여 세포 및 배양 상태로 고정합니다. 세포 배양 성장 접시에서 세포를 분리할 필요 없이 이미징이 가능한 유리 바닥 배양 접시를 사용할 수 있습니다.

이제 Dr cars에 적절한 라만 피크를 결정하는 방법을 살펴보겠습니다. 이중 공명 증강 효과를 제대로 활용하기 위해서는 두 라만 공명 물질의 라만 스펙트럼을 알고 있어야 합니다. 일반적으로 지질과 관련된 2,845 cm⁻¹과 중수소화된 포도당의 CD 신축 모드와 관련된 2,121 cm⁻¹이 이에 해당합니다.

두 레이저 사이의 주파수 차이가 분자 진동 주파수와 일치할 때 일관성 라만 산란이 발생합니다. 한 OPO를 817 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 레이저 빔과 결합하여 2,845 inverse centimeters C 모드를 측정하게 되며, 다른 OPO를 868 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 빔과 결합하여 2,121 inverse centimeter를 측정하게 됩니다. 분광 모드에서 CARS 현미경을 통해 우리가 관심을 갖는 세 가지 일관성 라만 신호를 관찰할 수 있는데, 이는 CH 신축 진동을 측정하는 CARS 신호, CD 신축 모드를 측정하는 CARS 신호, 그리고 두 가지 모두를 측정하는 DR CARS 신호입니다. 여기 표시된 도식에서 점선 화살표는 OPO 내 레이저의 광자를 나타내며, 실선 화살표는 결과적으로 발생하는 신호를 나타냅니다.

실선 수평선은 라만 진동의 에너지를 나타내며, DR 카에서는 동일한 세 개의 입력 광자를 혼합하여 두 개의 서로 다른 라만 진동을 동시에 탐색한다는 것을 시각적으로 보여줍니다. 각 피크의 신호 강도는 이 피크 위치 주변을 미세한 단계로 조정하여 최적화해야 합니다. 여기서는 각 피크를 선택하고 저농도 포도당 용액 내의 sea elgan worms 이미지를 촬영하며, 이렇게 개별적으로 얻은 세 개의 이미지를 기반으로 추가 정보를 추출하려면 상당히 간단한 이미지 프로세싱이 필요합니다.

먼저, 이미지를 정규화해야 합니다. 정규화를 위한 실용적인 방법은 지질이 소수성이라는 사실에 기반합니다. 이는 지질 밀도가 높은 영역에서는 포도당의 CD 공명이 이중 공명 신호에 거의 기여하지 않음을 의미합니다.

반대로, 순수 포도당 용액 영역에서는 지질의 CH 공명 또한 거의 기여하지 않아야 합니다. 이를 염두에 두고, DR car 이미지와 중수소화 포도당 용액의 CD 공명에서 얻은 car 이미지를 CH 공명이 나타나지 않아야 하는 CL egan's worm 외부의 영역을 기준으로 정규화하십시오. 다음으로, CH 공명 car 이미지 내의 worm 영역 중 지질이 풍부한 부위를 찾아 이를 정규화된 DR car 이미지의 해당 영역에 맞춰 정규화하십시오.

이 방법이 제대로 작동하려면, 이 영역의 깊은 곳에 중수소화 포도당이 존재하지 않는다고 가정합니다. 지질은 소수성이며 용액과 섞이지 않으므로 이는 타당한 가정입니다. 이제 정규화된 DR car 이미지에서 정규화된 CH 공명 car 이미지를 빼면 증폭된 CD 공명 신호만 남게 되며, 마찬가지로 정규화된 Dr.FWM 이미지에서 정규화된 CD 공명 car 이미지를 빼서 구할 수 있습니다.

증폭된 CH 공명 신호만 남겨둔 여기 표시된 것은 알킨 수식이 포함된 변형 올레산의 라만 스펙트럼입니다. 2,845 cm⁻¹에서의 강한 CH 공명과 2,121 cm⁻¹에서의 알킨 공명은 모두 피크가 밀집된 영역인 지문 영역으로부터 잘 분리되어 있어, 코히런트 라만 이미징을 위한 이상적인 마커가 됩니다. 이것은 세 개의 짧은 펄스 레이저가 시료 내에서 중첩될 때 생성되는 전형적인 코히런트 라만 신호의 스펙트럼입니다. 화살표는 에너지 도표로 표현된 각 신호의 원인이 되는 과정을 가리킵니다.

이 결과들은 DR CARS 및 CARS를 사용하여 C Elgin의 벌레를 이미징한 전형적인 결과입니다. 첫 번째 행에서는 앞서 보여드린 세 가지 신호를 사용하여 저농도 glucose 용액 내의 벌레를 이미징했습니다. 두 번째 행에서는 이미지들을 적절하게 정규화하였으며, 세 번째 행에서는 DR CARS 이미지에서 각각의 CARS 이미지를 빼줌으로써 차이 이미지를 생성하였습니다. 지금까지 이중 공명 결맞음 안티 스토크스 라만 현미경법(doubly resonant coherent antis Raman microscopy)을 기반으로 라만 차이 이미징을 수행하는 방법을 설명해 드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 빔이 적절하게 중첩되고 동기화되었는지 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 서로 다른 코히어런트 신호 간에 전환할 때 시료를 쳐서 움직이지 않도록 주의하십시오. 시료가 움직이면 분석에 영향을 미치기 때문입니다. 이상입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.