트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

형질 전환 동물의 형광 리포터 발현을 통해 살아있는 질병 모델에서 실험적 조작에 따른 세포 반응을 추적할 수 있습니다. 본 실험에서는 제브라피시에서 약물로 선택적 세포 소실을 유도하고, 고해상도 다색 공초점 이미지로 표적 세포와 인접 세포를 약물 처리 전, 처리 직후, 그리고 일정 간격으로 획득하였습니다. 이미지 분석 결과, 회복 단계 동안 내인성 줄기세포 집단의 활성화와 그에 따른 표적 세포의 대체가 일어남을 확인하였습니다.

이 방법은 개별 세포 유형을 재생하는 데 사용되는 세포 및 분자 메커니즘은 무엇인가와 같은 재생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수정 후 16시간에 교배를 통해 수집한 형질 전환란을 0.3 x danio solution이 담긴 페트리 접시에 옮기는 것으로 시작하십시오. 관심 조직에 색소 침착 증거가 나타나기 전에 PTU를 첨가하여 티로시나제(tyrosine ACE) 활성을 억제하십시오. 배아가 알비노가 아닌 경우, 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오.

리포터가 확인되면, 페트리 접시를 형광 실체 줌 현미경 아래에 두고 원하는 트랜스진 발현 여부에 따라 분류합니다. 이미징 전에, 배아 배지에서 0.5% low melt aeros 마운팅 용액을 준비하여 40 °C에서 보관하십시오.

필요한 경우 trica와 PTU를 첨가하십시오. 부드럽게 혼합한 후 40 °C로 되돌립니다. trica가 포함된 배아 배지에 물고기를 넣어 마취시키십시오.

약 3분 동안 물고기는 반응하지 않는 상태가 됩니다. 마이크로 파이펫을 사용하여 물고기를 옮기려면, 끝을 잘라낸 파이펫 팁에 약 30 µL의 마취액과 함께 개별 물고기를 흡입하십시오. 그다음, 파이펫을 뒤집어 물고기가 바닥에 가라앉도록 합니다.

팁을 마운팅 용액에 접촉시켜 중력에 의해 옮겨지도록 합니다. 마취제가 희석되지 않도록 주의하여 재사용할 수 있게 합니다. 마이크로 피펫에 남은 마취제 용액은 버립니다.

그런 다음 동일한 팁을 사용하여 물고기를 페트리 접시에 옮깁니다. 약 30 µL의 마운팅 용액 내에서, 관심 영역이 에어로스 방울 중앙에 오도록 물고기의 방향을 조심스럽게 잡습니다. 에어로스가 굳을 때까지 물고기가 원하는 방향을 유지하도록 하십시오.

원하는 경우 한 개의 Petri dish에 여러 마리의 물고기를 고정할 수 있습니다. aeros가 응고된 후, 물고기를 공초점 현미경 스테이지로 옮기고 물고기가 완전히 잠길 때까지 trica와 PTU 포함 여부에 따른 배아 배지를 dish에 조심스럽게 첨가합니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고 세포 또는 분자 세부 사항을 최적으로 촬영할 수 있도록 관심 영역에 초점을 맞춥니다.

소프트웨어에서 수치 구경(numerical aperture)이 높은 장작업거리(long working distance) 대물렌즈를 사용하십시오. 다이얼 목록에서 적절한 형광 채널(flora fours)을 선택하십시오. 스펙트럼 설정(spectral setting)을 클릭하고 방출 범위(emission ranges)를 조정하십시오.

리포터 신호를 깨끗하게 분리하고 신호 대 잡음비를 최대화하십시오. 소프트웨어로 정의된 사전 설정값이 적절하게 조정되도록 드롭다운 메뉴에서 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 레이저의 초점을 맞추고 출력 레벨을 설정하려면, 각 채널에서 픽셀 포화가 나타나는 출력값을 조회 테이블에서 선택하십시오.

다음으로, 원하는 이미지 품질을 얻을 수 있도록 검출기 감도를 설정하고, 이미지 강도가 적절해질 때까지 레이저 출력을 점진적으로 높입니다. 관심 영역에서 픽셀 포화가 일어나지 않도록 주의하고, 광퇴색 및 광독성 문제를 줄이기 위해 레이저 레벨을 가능한 한 낮게 유지하십시오.

모든 이미징 채널을 모니터링하면서 레이저를 수동으로 켜고 끄며, 각 레이저 라인이 해당 채널에서만 검출 가능한 신호를 생성하는지 확인하십시오. 크로스토크가 나타나지 않는다면 모든 채널을 동시에 획득할 수 있습니다. 다음으로, 줌 및 회전 기능을 사용하여 관심 영역의 프레임을 잡으십시오.

그 다음, 스캔 속도와 이미지 크기를 설정합니다. 더 빠른 스캔 속도를 사용하면 레이저 체류 시간이 최소화되고 시간 분해능이 향상됩니다. Z축 차원의 단계 크기는 실험적 필요에 따라 설정하십시오. 여기서는 망막 조직의 7개 광학 단면을 촬영하기 위해 10 microns의 단계 크기를 사용하였습니다.

적절한 설정이 결정되면 Zack 이미지를 획득하여 저장합니다. 그런 다음 다음 물고기로 이동합니다. 동봉된 서면 문서의 지침에 따라 며칠에 걸쳐 세포 변화를 추적하기 위해 연속적인 포획 및 방류 이미징을 수행할 수 있습니다.

다중 리포터 이미징 실험을 수행할 때는 서로 충분히 분리된 형광 색소를 사용하는 것이 가장 좋지만, 실제로는 그것이 항상 실용적인 것은 아닙니다. 본 영상에서는 오픈 소스 소프트웨어인 Image J를 이용해 들뜸 및 방출 프로파일이 겹치는 형광 색소를 분리하는 간단한 이미지 감산 방법을 소개합니다. 본 사례에서는 GFP와 YFP를 사용하였습니다.

본 영상에서 설명하는 타임랩스 이미징 기법은 망막 양극 신경세포의 절제 및 재생 과정 동안 GFP로 표지된 망막 줄기세포를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼 분리를 수행하려면 순차 이미징 모드와 가변 배리어 필터 설정을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 이를 통해 중첩되는 형광들을 각각 독립적으로 획득하거나 부분적으로 분리하여 획득할 수 있습니다. 이미지 획득이 완료되면, ImageJ loci bio formas 임포트를 사용하여 이미지 파일을 열고 임포트 도구를 시작하십시오. 분석하고자 하는 파일을 ImageJ 창으로 드래그하십시오.

Import 창의 split channels 체크박스를 사용하여 채널을 개별 스택으로 분리한 후 align three TP 플러그인을 시작하십시오. plugins를 클릭한 다음, align stacks를 선택하십시오. 이어서 align three tp를 클릭하십시오.

정확한 뺄셈(subtraction)을 위해 스택의 정렬이 필요합니다. 첫 번째 드롭다운 박스에서 참조 스택을 선택하고, 두 번째 박스에서 정렬되지 않은 스택을 선택하십시오. use XY relative origin과 use Z relative origin 확인란을 선택한 후 okay를 클릭하십시오.

정렬 프로세스를 시작하려면 볼륨 등록 버튼을 클릭하십시오. 정렬 파라미터가 포함된 새 창이 나타납니다. 확인을 클릭하십시오.

이 섹션은 플러그인 배포업체에 의해 최적화되었으므로 수정이 필요하지 않습니다. 완료되면 정렬된 스택 창이 나타납니다. 출력 창을 열려면 정렬된 창에서 출력을 선택하십시오.

이 창 또한 최적화되어 있어 수정이 필요 없습니다. 확인을 클릭하십시오. 파일 제목 끝에 aligned가 추가된 새로운 스택이 작업 공간에 나타납니다.

이미지 계산기(image calculator)를 사용하여 크로스토크(crosstalk)를 제거하려면, process를 클릭한 다음 image calculator를 선택하십시오. image one 드롭다운 상자에서 차감될 스택을 선택하고, image two 드롭다운 상자에서 차감에 사용할 스택을 선택하십시오. operation 드롭다운 상자에서 subtract를 선택한 후 okay를 클릭하십시오.

Image J에서 스택 처리 여부를 묻는 창이 나타나면 'yes'를 선택하십시오. 중첩된 채널 간의 크로스토크(crosstalk)가 제거된 새로운 스택이 생성됩니다.

정렬 및 감산 전과 동일한 이미지 구조를 재현하기 위해 스택을 병합하십시오. 채널 도구 창에서 병합할 채널을 선택하면 최대 4개의 스택을 하이퍼 스택으로 병합할 수 있습니다. 마지막으로, 채널에 색상을 입히고 밝기와 대비를 조절한 후 파일을 tiff 형식으로 저장하여 nitro reductase의 표적 손실 및 재생을 분석하십시오.

M cherry를 발현하는 망막 양극 세포. 처리 전 개별 제브라피쉬에서 촬영한 공초점 이미지의 시계열 데이터이다. 노란색으로 표시된 대조군 양극 세포에서는 막 표지 YFP 리포터가 모자이크 형태로 발현되며, 빨간색으로 표시된 표적 양극 세포에서는 니트로 리덕타제 cherry 융합 단백질이 발현된다.

청색으로 표시된 막 결합 CFP 트랜스진은 명확성을 높이기 위해 대부분의 다른 망막 세포에 대한 맥락 정보를 제공합니다. CFP 신호가 없는 동일한 이미지가 메트로니다졸 처리 후에 나타납니다. 적색의 니트로리덕타아제를 발현하는 양극세포는 소실된 반면, 황색의 대조군 양극세포는 보존되었습니다.

이는 이 절제 방법론의 매우 특이적인 성격을 보여줍니다. 다시 한번, 명확한 확인을 위해 CFP가 없는 동일한 이미지를 보여줍니다. metro NIAZ가 제거되면, NTR을 발현하는 세포들이 이곳으로 다시 돌아옵니다.

G-F-P-Y-F-P 감산법의 예가 이 그림의 GFP 표지 Mueller GL 세포(녹색)와 YFP 표지 양극 세포(보라색)에서 나타나 있습니다. 두 색상의 겹침 영역은 흰색으로 표시되며, 이를 통해 감산을 수행합니다.

먼저 GFP와 YFP 이미지를 정렬해야 합니다. 이후 감산 과정을 통해 GFP 이미지에서 YFP로 표지된 양극세포를 제거함으로써, GFP로 표지된 뮐러 글리아(Mueller glia)를 명확하게 나타내고 더 어두운 뮐러 세포를 검출할 수 있습니다. 이제 빨간색으로 표시된 어두운 뮐러 글리아와 M cherry로 표지된 양극세포 간의 중첩을 확인할 수 있습니다.

여기에 제시된 데이터는 양극세포(bipolar cell) 절제가 뮐러 글리아(muller ggl)를 자극하여 소실된 세포를 대체하도록 한다는 점을 시사합니다. 이러한 해석은 포유류와 어류 모두에서 뮐러 글리아가 손상 유도 전구세포로 작용한다는 최근의 망막 재생 연구들과 일치합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 제브라피시의 줄기세포 시각화를 통해 특정 세포 유형의 재생을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.