Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

췌도 이식은 1형 당뇨병의 잠재적 치료법으로 제안되어 왔습니다. 하지만 두 가지 주요한 한계점으로 인해 광범위한 임상적 적용이 어려운 실정입니다. 첫째, 수혜자당 다량의 췌도가 필요하다는 점입니다.

섬-섬(eyelets)은 장기 기증자로부터 얻기 때문에 잠재적 수혜자의 수가 매우 제한적입니다. 2차 이식은 평생 강력한 면역억제제 치료가 필요하며, 이는 환자, 특히 소아 인구에게 악성 종양, 감염 및 신부전의 위험을 초래합니다. 임상적 이식 결과를 개선하기 위한 전략을 연구하기 위해 마우스 신장 캡슐 하 섬-섬 이식이 수행됩니다.

건강한 공여 마우스에서 분리한 소도(eyelets)를 그룹별로 분류하여 이식 준비를 합니다. 그다음 소도를 신장의 피막하 공간에 이식합니다. 당뇨병 수 recipient 마우스에서 소도 이식편의 기능을 혈당 수치 모니터링을 통해 평가하며, 이를 통해 약 250~350개의 소도를 이식하면 20 g의 수 recipient 마우스에서 이식 후 24시간 이내에 혈당 수치가 정상으로 회복됨을 확인할 수 있습니다.

캐뉼라 삽입 단계에 있어 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 총담관의 캐뉼라 삽입과 신장 피막 하 공간으로의 아이렛(eyelet) 전이는 습득하기 어렵습니다. 이러한 단계에서는 조직 구조의 식별, 정교한 손놀림, 그리고 조직 손상을 최소화하는 기술의 사용이 요구됩니다.

안락사시킨 마우스를 해부 현미경 아래의 종이 타월 위에 배를 하늘로 향하게 하여 눕히고, 복부에 70% ethanol을 분사합니다. 가위를 사용하여 치골 부위에서 양쪽 앞다리 방향으로 V자형 절개를 하여 복부를 엽니다. 마우스가 해부 현미경 아래에 위치해 있습니다.

머리가 관찰자를 향하도록 배치합니다. 지혈鉗子(hemostat clamp)를 사용하여 총담관의 십이지장 유입구, 즉 총담관의 십이지장 개구부를 찾습니다. 지혈鉗子는 압착했을 때 췌장-장 경계를 따라 정확하게 위치하도록 배치해야 합니다.

담관을 캐뉼레이션하는 두 가지 방법을 시연하겠습니다. 담관 캐뉼레이션을 위한 프리핸드법(free hand method)과 포셉 보조법(forceps assist method)입니다. 프리핸드법을 사용할 때는 십이지장에 고정된 지혈 겸자를 쥐의 머리에서 꼬리 방향으로 당겨 총담관이 팽팽해지도록 합니다.

담낭에서 배출되는 담즙과 간에서 분비되는 효소가 합쳐지는 간 근처의 담관 합류 지점이 있습니다. 장으로 들어가기 전, 담관을 팽팽하게 당겨 V자 모양의 안쪽 위치를 노출시킵니다. 5 mL 주사기에 연결된 굽은 27 gauge 바늘을 사용하여 바늘이 V자 부분을 그대로 통과하게 하여 담관의 하단을 직접 캐뉼라합니다. 간과 담낭으로 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 베벨 끝보다 수 밀리미터 더 깊게 삽입하십시오.

캐뉼라 삽입에 성공하면, 주사기로 liase 2 mL를 투여하여 췌장을 관류합니다. 최적의 캐뉼라 삽입 여부를 확인하기 위해 췌장이 위 위쪽으로 팽창하는지 관찰하십시오. 또는 담관에 캐뉼라를 삽입할 수도 있습니다.

포셉 낭(forceps cyst) 방법을 사용합니다. 십이지장에 고정된 지혈집게 C를 생쥐의 머리 반대 방향인 꼬리 쪽으로 당겨 총담관이 팽팽해지게 합니다. 그런 다음 5 mL 주사기에 연결된 굽은 27 gauge 바늘을 사용하여 간 근처의 총담관 아래쪽 근막을 천자합니다.

바늘을 그대로 둔 상태에서 바늘을 사용하여 관에서 근막을 제거합니다. 지혈鉗(hemostat)를 내려놓고 핀셋을 집어 듭니다. 벌려진 핀셋의 한쪽 팔을 사용하여 바늘로 근막을 제거한 담관 부위를 지지하면서, 담관과 핀셋을 앞으로 당깁니다.

포셉을 지지대로 사용하여 바늘을 도관 속으로 밀어 넣습니다. 성공적으로 캐뉼레이션(cannulation)이 되면 위 상단의 췌장 부위가 고르게 팽창합니다. 췌장에 관류가 이루어지면 십이지장에서 지혈鉗(hemostat)을 제거합니다.

그 다음 핀셋을 사용하여 십이지장을 들어 올리고, 두 번째 핀셋을 사용하여 췌장을 장에서 분리합니다. 이어서 췌장을 위의 상단과 비장에서 떼어냅니다. 마지막으로 췌장을 복부 밖으로 들어 올린 후, 장, 위, 비장에 연결된 나머지 근막 연결 부위를 절단하여 완전히 분리합니다.

췌장을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 둡니다. 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 췌장을 37 °C에서 배양합니다. 배양 후, 튜브에 배지 20 mL를 추가하고 10초 동안 40회 강하게 흔들어 조직을 분리합니다.

이 단계는 바이올렛의 최적 회수를 위해 매우 중요합니다. 세포를 800 rpm으로 원심분리하십시오. 부유물을 15 mL의 배지에 재현탁하고 샘플을 농축하십시오.

재현탁된 슬러리를 0.419 millimeter 와이어 메시로 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리관에 넣습니다. 첫 번째 튜브를 10%fetal bovine serum이 함유된 배지 10 milliliters로 헹구어 와이어 메시를 통해 함께 붓습니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 상온의 histopaque 1077 5 milliliters로 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 수 초 동안 가볍게 볼텍싱합니다. histopaque 5 milliliters를 추가로 넣고 튜브 내벽을 따라 돌려 벽면에 붙은 세포들을 씻어냅니다. serum free RPMI 10 milliliters를 튜브 벽면을 따라 10초당 1 milliliter의 속도로 천천히 피펫팅하여 층을 형성합니다.

뚜렷한 경계면이 관찰되어야 합니다. 그다음, 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 20 °C에서 900 ×g로 20분 동안 원심분리하되, 가속도는 매우 낮게 설정하고 제동은 걸지 마십시오. 원심분리 후, 일회용 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 췌도(islets)를 외분비 세포로부터 분리합니다. HistoPaque 배지 경계면에서 췌도를 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

이 단계에서 여러 개의 튜브를 모아 잔류 islet을 제거할 수 있으며, 혈청 함유 배지로 불투명한 튜브를 채운 후 800 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 islet을 펠릿화합니다. 그 다음, islet을 신선한 배지에 다시 현탁합니다. 이 단계를 최소 2회 반복합니다.

펠렛을 5 mL의 배지에 현탁합니다. 15 mL 원추형 튜브 위에 0.1 mm 나일론 세포 스트레이너를 뒤집어서 배치합니다. 현탁된 세포 슬러리를 피펫으로 스트레이너에 통과시켜 아이렛(eyelets)을 수집합니다.

그런 다음 50 mL 튜브를 배지 6 mL로 추가 헹구고 거름망(strainer)에 통과시킵니다. 10 cm 페트리 접시에 배지 3 mL를 한 방울 떨어뜨립니다. 셀 거름망을 뒤집어 배지 방울에 담가 아이렛(eyelets)을 수집하고, 5~7 mL의 배양액을 추가로 피펫팅하여 거름망을 통해 페트리 접시에 넣습니다.

4배 대물렌즈 하에서 스트레이너에 남아 있는 안구 입자를 수집하려면, P 200 피펫으로 안구 입자를 개별적으로 채취하여 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 이미지들은 12주령 C 57 black six 마우스에서 분리한 안구 입자를 보여줍니다. 분리 절차가 완료된 후 현미경을 통해 안구 입자의 순도와 품질을 추정할 수 있습니다.

예를 들어, 여기에 제시된 두 이미지는 잔해물과 외분비 세포 오염이 존재하는 대표적인 시야를 보여줍니다. 실험을 위해 아이렛(eyelet)을 선택할 때, 오염된 외분비 세포나 상태가 좋지 않아 보이는 아이렛은 피하십시오. 분리 24시간 후 촬영한 이 그림에서 볼 수 있듯이 중심부가 괴사된 아이렛은 건강하지 않은 상태이며, 괴사된 중심부는 분리 직후에는 보이지 않습니다.

세포가 탈락하는 아일렛(eyelet)은 불가피하며, 아일렛의 24시간 타임랩스 영상에서 볼 수 있듯이 아일렛 이식에 사용될 수 있습니다. 분리 직후, 많은 아일렛 내부에 괴사 중심부(necrotic centers)가 형성됩니다. 아일렛을 선택하는 과정 중 녹화 마지막 단계에서 이러한 괴사 중심부가 아일렛 밖으로 배출되는 것으로 보입니다.

각 튜브에 아일렛의 품질과 크기가 균등하게 분포되도록 그룹화합니다. 예를 들어, 15개의 아일렛으로 구성된 각 그룹에는 대형 아일렛 4개, 중형 아일렛 6개, 소형 아일렛 5개가 포함될 수 있습니다. 튜브를 얼음에 둡니다. 아일렛은 즉시 이식에 사용하거나 조작할 수 있습니다.

사용 전, 멸균된 젤 로딩 팁을 1.5 mL 마이크로 튜브의 입구에 넣어 팁의 좁은 끝부분이 U자형으로 완만하게 구부러지도록 합니다. 팁의 양쪽 끝이 모두 마이크로 튜브 밖을 향해 위로 똑바로 향해 있어야 합니다.

얼음에서 아이렛(eyelet) 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 모든 아이렛이 튜브 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. P 200 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 최소량의 부피로 아이렛을 조심스럽게 수집한 후, 준비된 곡선형 팁(curved tip)으로 옮깁니다.

아이렛(islet)이 가라앉은 후, 아이렛이 담긴 젤 로딩 팁의 넓은 개구부를 통해 배지를 흡입하여 팁 끝에서 배지를 최대한 제거합니다. P 200 피펫에 새 젤 로딩 팁을 장착하십시오. 튜브의 비경사단(non beveled end)을 아이렛이 담긴 젤 로딩 팁의 좁은 개구부에 연결합니다. 그런 다음 팁을 P 200 피펫에 장착하고 아이렛을 튜브 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.

다음으로, PE 50 튜브의 비스듬하지 않은 끝단을 25 µL Hamilton 시린지의 바늘에 연결합니다. 플런저를 당긴 상태에서 시린지의 플런저를 눌러 아이렛(eyelets)이 비스듬한 개구부로부터 약 0.5 cm 거리까지 오도록 합니다. 신장을 아이렛 수용 준비 시키는 동안, 아이렛이 튜브의 비스듬한 개구부 근처에서 하나의 덩어리로 모여 안정될 수 있도록 시린지를 옆으로 놓아둡니다.

털을 깎고 Betadine과 70% isopropyl alcohol을 교대로 세 번 사용하여 피부를 세척하여 수술 부위를 준비합니다. 수혜 마우스의 발가락 집기(toe pinch)를 통해 마취 상태를 확인하여 아이렛 이식 절차를 시작합니다. 유리 막대의 축을 마우스 바로 아래, 신장 하단에 척수와 수직이 되도록 배치합니다.

그런 다음 피부를 통해 신장의 위치를 확인하고 멸균 수술포를 덮습니다. 신장 위치가 확인되면 McFerson banis 가위를 사용하여 신장 바로 위의 진피층에 척수와 수직이 되도록 2cm 길이로 절개합니다. 이 절개를 통해 가위로 복벽을 노출시킵니다.

유리 막대의 샤프트를 받침대로 사용하여 피부층을 절개한 방향과 동일하게 복막벽을 1cm 절개합니다. 인접한 표면을 눌러 복막 개구부를 통해 신장이 밀려 나오게 합니다. 적신 면봉을 사용하여 노출된 신장 표면을 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 적셔줍니다. 신장 캡슐이 건조해지는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 몇 분마다 이 단계를 반복합니다.

27게이지 바늘을 사용하여 신장 캡슐의 전면을 가로질러 0.2cm 절개를 만듭니다. 좌측 외측에서 우측 외측 방향으로 화염 연신 유리 모세관을 삽입합니다. 앞서 만든 절개 부위를 통해 탐침하고, 신장의 배측 외측면을 따라 후방 방향으로 이동시킵니다.

신장 캡슐과 신장 실질 사이에 파우치를 만들기 위해, 준비된 25 milliliter Hamilton 주사기의 아이렛을 유연한 튜브의 비스듬한 개구부 가장자리까지 이동시킵니다. 그런 다음 비스듬한 모서리가 위를 향하도록 하여 캡슐 하부 파우치에 삽입합니다. 이때 긴 모서리가 신장 실질과 접촉하게 됩니다.

튜브를 캡슐의 가장 후방 끝으로 이동시킵니다. 그런 다음 시린지의 플런저를 눌러 PE 50 튜브에 들어있는 아이렛(eyelets)을 캡슐 하부 포켓(subcapsular pouch)으로 천천히 옮깁니다. 아이렛이 포켓을 채우면, 더 많은 공간을 확보하기 위해 유연한 튜브를 천천히 뒤로 뺍니다.

튜브를 파우치에서 제거한 후, 유리 프로브를 신장 표면을 따라 앞쪽에서 뒤쪽으로 밀어 아이렛(eyelet)을 파우치의 근위단으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 굴곡형 포셉(bent arm forceps)을 사용하여 신장을 위해 만들어진 개구부 주변의 복막 내벽을 들어 올립니다. 그런 다음 PBS에 적신 면봉을 사용하여 신장을 복강 안으로 부드럽게 다시 밀어 넣습니다.

복벽에는 봉합사를 사용하고 진피층에는 상처 클립을 사용하여 마우스의 절개 부위를 폐쇄합니다. 마우스를 케이지로 돌려보내고 상태를 모니터링합니다. 회복을 위해 마우스의 장 건강을 돕는 아세토메인 수(aceto meine water)를 제공해야 합니다.

C 마우스 안구 조직을 분리했습니다. 이 비디오에서 설명한 방법을 사용하여 치료 용량을 동종 C 57 black six 마우스에 이식했습니다. 수술 후 1일째부터 공복이 아닌 상태의 혈당 수치를 모니터링했습니다.

동종 공여체로부터 300개의 안구 조직(eyelets)을 이식받은 20g의 수혜 쥐에서는 약 17일경에 거부 반응이 나타납니다. 동종 공여체로부터 150개 또는 300개의 안구 조직을 이식받은 쥐들을 대상으로 회복 상태를 관찰하였습니다. 이들 이식에서는 안구 조직이 동종 공여체로부터 유래되었으므로 거부 반응이 나타나지 않습니다.

투여된 islet 용량은 이식 직후 islet의 주요 기능을 측정합니다. 150개의 islet을 이식했을 때는 부분적인 회복이 관찰된 반면, 300개의 islet을 이식했을 때는 완전한 회복이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 마우스 islet을 분리하고 이를 신장 피막하 공간에 이식하는 데 필요한 핵심 단계들을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

연습을 통해 이 프로토콜에서 가장 어려운 단계인 총담관 캐뉼라 삽입을 빠르게 수행하는 능력을 기를 수 있을 것입니다.