이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 RBB2 히스톤 탈메틸화효소인 KDM5A1의 게놈 타겟을 식별하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 적절한 크기의 DNA 단편을 생성하기 위해 초음파 처리를 거친 교차 결합 크로마틴을 준비함으로써 달성됩니다. RBB2가 결합된 DNA 단편은 RBB2 항체를 사용하여 면역 침전시킵니다.

다음으로, 회수된 게놈 DNA를 PCR로 증폭하여 시퀀싱을 진행합니다. 마지막으로, Illumina로 시퀀싱된 short read를 인간 게놈에 고유하게 정렬(align)하고, 유의미한 피크를 식별하여 가장 가까운 유전자에 주석을 답니다. Rbbb two를 식별하기 위해, 게놈 전반의 Rbbb two 농축 영역 식별을 바탕으로 Rrb B two 표적 유전자 두 개와 관련된 분자 기능을 보여주는 결과물을 얻습니다.

안녕하세요, 저는 시카고 일리노이 대학교 생화학 및 분자유전학과의 Elizabeth Bencia 박사 연구실 소속 Mike입니다. 그리고 저는 BARCEL 생의학 연구 단지 대학의 NGA 박사가 이끄는 생의학 유전체학 연구실 소속 ala입니다.

저는 Danielle Dal입니다. 그리고 저는 William Richter입니다. 저희 둘 다 Benevolence Skill Lab 소속입니다.

오늘은 염색질 면역침강 및 시퀀싱 절차에 대해 설명하겠습니다. 저희 실험실에서는 히스톤 탈아세틸레이스의 결합 부위를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, 면역침전법(immunoprecipitation 또는 ip) 1회당 약 10⁸개의 세포를 배양하십시오. 여기서는 미만성 골용해성 림프종 세포를 사용합니다.

U 9 37 세포를 사용하며, 세포 성장 후 TPA를 사용하여 96시간 동안 단핵구 분화를 유도합니다. 포름알데히드 용액을 배지에 직접 첨가하여 최종 농도가 1%가 되도록 합니다. 그다음 플라스크를 가볍게 흔들어 섞은 후 실온에서 10분 동안 둡니다. 이어서 배지를 흡입하여 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS 15 milliliters로 세포를 세척합니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 얼음 위에서 각 플라스크에 6 mL의 lysis buffer one을 첨가합니다. 그런 다음 4 °C에서 20분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 마지막으로, 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 회수하고 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

이 시점에서 세포는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 세포를 동결했다면, 이를 해동하십시오. 해동 후 세포를 원심 분리하여 상층액을 제거하십시오.

그 다음 세포를 6 mL의 lysis buffer two에 재현탁하고, 실온에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다. 원심분리를 반복한 후 세포를 2.5 mL의 lysis buffer three에 재현탁합니다. 다음으로, Branson 450 sonicator의 마이크로 팁을 50~60% 진폭으로 설정하고 현탁액을 얼음물이 담긴 비커에 넣어 초음파 처리를 준비합니다.

용액을 32초 동안 일정하게 초음파 처리하고 얼음 위에서 냉각합니다. 1분 동안 이러한 펄스 처리를 10~15회 반복한 다음, 튜브의 내용물을 피펫으로 위아래로 섞어 새로운 튜브로 옮깁니다. 용액에 대해 펄스 처리와 냉각을 계속 진행합니다.

초음파 처리 후 5회 더 추가로, 용액 부피의 1/10에 해당하는 10% Triton X 100을 첨가합니다. 그 다음 용해물을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 크로마틴 면역침강 또는 ChIP을 수행하기 전에 마이크로 원심분리기로 찌꺼기를 제거합니다. 세포 용해물 50 µL를 입력 샘플로 저장합니다.

그런 다음, 서면 프로토콜에 기술된 대로 미리 준비한 항체가 결합된 dyna beads를 투명하게 정제된 세포 용해물과 혼합합니다. 50 µL의 입력 시료를 추가하여 혼합물을 4 °C에서 밤새도록 쉐이킹합니다. 1 mL의 세척 완충액으로 비즈를 세척합니다.

그 다음 자성 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 상층액을 제거합니다. 이 세척 과정을 6~8회 반복합니다. 마지막으로 1 mL의 TE와 50 mM sodium chloride를 혼합하여 최종 세척을 수행합니다.

원심 분리 후 마이크로 원심분리기로 비드를 스핀 다운하고, 잔류 TE 버퍼를 흡입하여 제거합니다. 그 다음, 샘플에 100 µL의 용출 버퍼를 즉시 첨가합니다.

샘플을 65 °C에서 10~15분 동안 배양합니다. 비드가 부유 상태를 유지하도록 2분마다 1.5 mL 튜브 랙에 튜브를 가볍게 긁어줍니다. 원심분리와 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 수집하고 SNAT를 PCR 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 이전에 저장해 둔 입력 샘플을 회수하고 용출 버퍼를 3배 부피만큼 첨가합니다. 마지막으로, IP 샘플과 입력 샘플을 서멀 사이클러에 넣고 65 °C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 다음 날 가교 결합을 해제하기 위해 샘플에 TE 버퍼를 1배 부피만큼 첨가합니다.

그런 다음 RNAs A를 최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 첨가합니다. 시료를 서멀 사이클러(thermal cycler)에서 37 °C로 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, proteinase K를 최종 농도가 0.2 µg/µL가 되도록 첨가합니다.

그 후 서멀 사이클러(thermal cycler)에서 샘플을 55 °C로 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1부피의 페놀(phenol)을 사용하여 샘플을 1차 추출합니다. 이어서 1부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(phenol chloroform isoamyl alcohol)을 사용하여 샘플을 2차 추출합니다.

마지막으로 클로로포름-이소아밀 알코올 1부피로 샘플을 다시 한번 추출합니다. 그 다음 각 샘플에 30 µg의 글리코겐을 첨가합니다. 또한, 최종 농도가 0.2 M이 되도록 염화나트륨을 첨가하고, 샘플에 2부피의 에탄올을 첨가합니다.

-80°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 샘플을 원심 분리하고 상층액을 따라냅니다. 펠렛을 500 µL의 75% ethanol로 세척한 후, 펠렛을 건조시키고 40 µL의 물에 재현탁합니다.

SONICATION 과정으로 생성된 DNA 단편의 크기를 확인하려면, 정제된 입력 시료 5 µg을 1.8% 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동을 수행하십시오. 초음파 분쇄 과정은 150에서 350 base pairs 범위의 단편을 생성해야 합니다. 만약 단편의 크기가 이 범위에 해당하지 않는 경우, 게놈 DNA 증폭 전에 버스트 횟수와 진폭을 조절하여 초음파 분쇄 과정을 조정해야 합니다.

서면 프로토콜에 기술된 대로 샘플의 크기, 농도 및 농축도를 확인하십시오. 게놈 DNA 증폭을 시작하려면, IP 샘플 34 µL와 input 샘플 200 ng를 준비하십시오. 서면 프로토콜에 기술된 대로 Illumina 게놈 DNA 샘플 프렙 키트를 사용하여 DNA 단편에 a-tail 추가 및 어댑터 라이게이션을 수행하고 수선하십시오.

mini lut PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제한 후, 50 °C로 예열한 buffer EB로 용출합니다. IP 및 input DNA 샘플에 대해 각각 23 µL와 46 µL를 사용하십시오. 어댑터가 포함된 DNA 23 µL와 키트 제공 fusion DNA polymerase 25 µL를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.

20 µM의 sole PCR one 1 µL와 20 µM의 sole PCR two 1 µL를 넣습니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 PCR 반응을 수행합니다. PCR 증폭 후, Qiagen mini loop PCR purification kit를 사용하여 DNA를 정제합니다.

15 µL의 buffer EB를 50 °C로 예열하고, 샘플 0.5 µL를 1:4로 희석한 후 NanoDrop 측정을 수행하여 증폭 산물을 정제합니다. HPLC 등급의 물 50 mL를 사용하여 1.8% AGROS 겔을 준비하고, AGROS가 녹은 후 TAE와 bromide를 첨가합니다. 그 다음 겔을 붓고 샘플을 로딩합니다.

입력(input) 및 면역침강(IP) 시료에 4 µL의 로딩 버퍼를 추가한 후, 120 V에서 45분 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료된 후 겔을 분석합니다. 분석 결과 150~350 bp 범위의 단편들이 생성되었음을 확인할 수 있어야 합니다.

이들은 길이가 50에서 250 base pairs 사이인 genomic DNA 단편들입니다. 그리고 메스로 150에서 350 base pair 범위의 물질이 포함된 겔 영역을 절제합니다. 이때 약 120 base pairs에서 나타나는 adapter band를 절제하지 않도록 주의하십시오.

제조사의 지침에 따라 kayak quick gel extraction kit를 사용하여 DNA를 회수하십시오. 가열하지 않은 상태에서 speed back을 이용해 샘플을 정확히 11 µL가 되도록 건조하십시오. 샘플에서 1 µL를 취해 NanoDrop 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정하십시오.

마지막으로, Illumina 게놈 분석기를 사용하여 농축된 유전자 산물을 식별하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 결합 부위와 표적 유전자를 분석합니다. 식별된 농축 RB 결합 단백질 2 또는 RBP2 결합 영역의 게놈 좌표는 염색체별 형식으로 제시됩니다. 염색체 내 앙상블 유전자의 점유 상태는 검은색 막대로 시각화할 수 있습니다.

여기서는 염색체 10번의 점유 상태가 나타나 있으며, rbp two 결합 영역이 수직선으로 표시되어 있습니다. 중간 패널에는 염색체 10번 상의 모든 rbp two 이소형 결합 영역이 표시되어 있고, 하단 패널에는 rbp two 대형 이소형 결합 영역이 표시되어 있습니다. 이 정보는 염색체 10번에서 RBP two 이소형들의 중첩 및 특이적 점유 상태에 대한 개요를 제공합니다.

여기 rbp에 결합된 유전자들 중, 허위 발견율(false discovery rate) 또는 FDR로 보정하여 유의미하게 농축된 유전자 온톨로지(gene ontology) 또는 go 분자 기능 카테고리를 나타낸 히트맵이 제시되어 있습니다. 빨간색에 가까운 두 가지 색상은 통계적 유의성이 높음을 나타냅니다. 노란색은 통계적 유의성이 낮음을 나타내며, 회색은 통계적 유의성이 없음을 나타냅니다.

농축 분석(Enrichment analysis)을 통해 R BP two 표적 유전자의 중첩 및 이소형 특이적 분자 기능을 확인할 수 있습니다. 앞서 이 과정에서 전사 인자 결합 부위를 식별하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차에서는 적절한 크기 범위와 수율의 DNA 단편을 생성하는 것이 중요합니다.

이는 초음파 처리(SONICATION) 단계에서 저희의 가이드라인을 따름으로써 달성할 수 있습니다. 이것으로 모두 끝났습니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바라며, 시청해 주셔서 감사합니다.