어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

우리의 시각적 경험은 망막 광수용체의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수함으로써 시작되며, 이는 최종적으로 세포막의 cyclic nucleotide gated channel의 폐쇄로 이어집니다. 이는 간상세포와 원추세포 모두에서 신경전달물질인 glutamate의 방출을 억제합니다. 방출된 glutamate는 하위 망막 세포에 의해 감지되어 하위 신호를 연구하는 데 사용됩니다.

안락사시킨 마우스에서 안구를 적출합니다. S를 분리하여 한천 블록에 매립한 후 진동 마이크로톰을 사용하여 절편을 만듭니다. 다음으로, 망막 절편을 현미경 아래에 배치하고 LED 조명으로 자극합니다.

시냅스 전류 또는 전위를 측정하기 위해 패치 클램프 기록을 수행합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 암실에서 작업해야 하는 추가적인 복잡성으로 인해 어려움을 겪습니다. 따라서 전체 과정을 시각적으로 확인하는 것은 말로 설명하기 어려운 실질적인 감각을 익히는 데 도움이 될 것입니다.

사용할 기록 및 기준 전극 와이어를 염화은 층으로 코팅하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 전극을 1 M 염화나트륨 용액에 담급니다. 그런 다음 1 Hz 사인파 구동 방식의 15 V 전원을 사용하여 약 20초 동안 두 전극 사이에 15 V를 인가합니다.

마이크로 피펫 풀러를 사용하여 화염 연마된 BO 실리카 유리로 패치 피펫을 제작하며, 직경 약 20 µm의 세포체와 같은 표적 세포의 크기에 따라 피펫 팁 저항을 선택합니다. 세포체의 경우 5~10 MΩ의 팁 저항을 가진 피펫을 사용하십시오. 직경이 약 5 µm 이하인 경우에는 12~15 MΩ의 팁 저항을 사용하십시오.

접지 참조 전극을 준비하려면, 1 mM 염화나트륨으로 조제한 3.5% agar 용액을 시린지를 사용하여 폴리에틸렌 튜브에 채웁니다. 다음으로, 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 외부 배스 용액(external bath solution), 절편 제작 용액(slicing solution), potassium aspartate 피펫 내부 용액 및 agar 백스톱(backstop) 용액을 준비합니다.

모든 용액은 필요할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 실험 당일에 약 1.5 mL의 potassium aspartate 내부 용액을 넣습니다. 그다음 희석된 Fluor를 추가하십시오.

중탄산나트륨이 포함된 aims 배지 약 50 milliliters를 차광 보관 용기에 붓습니다. 가스 탱크에 연결된 플라스틱 튜브를 사용하여 5%carbon dioxide와 95%oxygen 혼합 가스로 aims 배지를 평형화한 다음, 용기를 30 to 32 degrees Celsius 항온수조에 넣습니다. 이어서, HEPES가 포함된 aims 배지 110 milliliters를 병에 채워 얼음 위에 둡니다.

100% 산소 가스를 용액에 버블링하여 배지를 평형화합니다. 탄산수소나트륨이 포함된 나머지 aimes 배지를 패러데이 케이지 상단의 가열 저장조에 넣습니다. 용액 상단 공간에 가스를 가두고 5% 이산화탄소 및 95% 산소 가스로 평형을 맞추기 위해 튜브와 병 뚜껑 부분을 파라필름으로 감쌉니다.

유리 공기 분산 튜브를 사용하여, 0.75g의 저융점 아가로즈를 25mL의 aims 배지에 첨가하고 가열하여 3% 저융점 아가로즈 용액을 준비합니다. 교반하면서 용액의 온도를 약 115°C까지 올립니다. 기포 없이 용액이 투명해지면, 녹은 아가로즈 용액을 42°C 항온수조에 넣습니다.

도립 현미경 위에 기록 챔버를 설치합니다. 5cm 길이의 한천 브릿지를 은/염화은 기준 전극 위로 밀어 넣고 기록 챔버 내에 배치합니다. 피펫을 내부 용액으로 채우고, 피펫 홀더에 고정한 뒤, 피펫 홀더를 증폭기 헤드 스테이지에 장착하고, 피펫을 용액 속으로 내려서 피펫 팁 저항을 측정할 수 있습니다. 생리학적 기록을 위해 시각 색소를 보존하려면 모든 과정은 적외선 고글을 착용한 상태에서 적외선 조명 하에 수행해야 하지만, 여기서는 모든 과정을 실내 조명 아래에서 보여줍니다.

마우스를 안락사시킨 후, 곡선 가위를 사용하여 빠르게 안구를 적출합니다. 안구가 굴러가지 않도록 거름종이 위에 올려놓습니다. 그런 다음 핀셋으로 안구를 고정한 상태에서 얇은 양날 칼날을 사용하여 각막에 절개선을 만듭니다.

안구를 천공하자마자, 안구를 aims 배지가 채워진 60mm 페트리 접시에 옮깁니다. 각막의 절개 부위를 진입점으로 삼아, 작은 가위를 사용하여 각막의 나머지 부분을 잘라냅니다.

그런 다음 수정체와 유리체를 제거하며, 이때 망막이 안구 컵에 부착된 상태로 유지되도록 합니다. 이를 32 °C에서 95% oxygen과 5% carbon dioxide로 평형을 맞춘 aims Medium이 채워진 차광 용기에 넣습니다.

다음 반구 단면을 절개합니다. 10번 메스 날을 사용하여 안구 컵 중 하나를 절개합니다. 망막을 망막색소상피에서 분리합니다.

망막의 가장자리를 제거하여 조직이 평평하게 펴질 수 있도록 합니다. 라텍스 벌브가 달린 작은 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 35mm 페트리 접시에 녹인 저융점 아가로스를 채우고, 포셉을 아가로스 위로 끌어 일관성을 확인합니다. 아가로스가 굳기 시작하면 망막을 아가로스 위에 옮깁니다.

그 후 망막에 닿지 않게 주의하며, 꼬아 만든 킴와이프(Kim wipe) 조각을 사용하여 주변의 과잉 용액을 흡수합니다. 망막 위에 한천(agar)을 2~3방울 더 직접 떨어뜨리고, 망막이 실린더 중심 근처에 위치하도록 유지하면서 플라스틱 실린더를 빠르게 배치하여 주변에 벽을 형성합니다. 녹인 한천을 추가로 떨어뜨린 후, 페트리 접시를 얼음물 수조로 옮겨 냉각시킵니다. 30초 후, 조직을 꺼내고 플런저를 사용하여 망막에서 가장 먼 쪽 측면부터 밀어내어 한천 블록을 압출합니다.

단면 면도날을 사용하여 망막이 포함된 작은 아가로스 블록을 잘라내고, 시편 디스크의 아가로스 백스톱에 맞게 블록을 순간접착제로 고정합니다. 시편 디스크를 진동 마이크로톰 트리에 옮기고, 망막이 포함된 블록이 완전히 잠기도록 매우 차가운 Aims heaps를 트리에 붓습니다. 블록의 전진 속도를 망막을 한 번 절단하는 데 4~5초가 걸리도록 설정하고, 최대 블록 진동 속도를 사용하여 약 200 microns 두께의 망막 절편을 제작합니다.

11번 메스 날을 사용하여 블록에서 사용 가능한 절편을 하나씩 잘라냅니다. 망막이 포함된 절편을 기록 챔버에 넣고 고정합니다. 슬라이스 앵커를 사용하여 나일론 실로 절편을 고정합니다.

망막 주위의 한천(agar)을 눌러 고정하되, 망막은 가려지지 않게 합니다. 기록을 위해 기록 챔버를 정립 현미경의 스테이지로 옮깁니다.

커튼을 닫고 적외선 광원을 켜서 적외선 감지 카메라로 절편을 관찰합니다. 현미경 하에서 적절한 절단 각도로 광수용체가 온전하게 보존된 망막 절편을 확인합니다. 절단 과정으로 인해 일부 표면 손상이 나타날 수 있습니다.

끝단이 부러진 피펫을 사용하여 죽은 세포체를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 건강한 생존 세포층이 드러나면, 이 얇은 세포층을 제거하고 관심 있는 층에 위치한 세포체를 확인합니다. 피펫 팁을 이동시켜 세포막에 살짝 자국이 남게 한 뒤, 완만한 음압(내향 압력)을 가해 고저항 밀봉(high resistant seal)을 형성합니다. 전극에 음압을 가해 세포 내부로 진입함으로써 전세포 모드(whole cell mode)를 구현할 수 있습니다.

다음으로, LED를 사용하여 망막 조직에 빛 자극을 주어 반응을 유도합니다. 기록이 끝나면, 피펫 내부 용액으로부터 세포 내로 투석된 형광 물질(Fluor)에 적합한 여기광을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 여기서는 암적응된 망막 뉴런이 강도가 증가하는 섬광 자극에 대해 나타내는 빛 유발 전위를 보여줍니다.

이 그림은 세포에 Fluor Lucifer yellow를 충전한 망막 절편에서 촬영한 형광 사진으로, 패치 기록(patch recording)이 수행된 세포들의 형태를 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 암적응된 망막 절편에서 패치 클램프 기록을 수행할 때 발생하는 몇 가지 복잡한 사항들에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다. 이 실험 절차의 목적은 제어된 조명 조건 하에서 빛 유발 반응을 측정하는 것입니다.

이를 위해 먼저 망막을 분리하여 아가로즈(agarose)에 매립한 다음, 단일 세포 기록이 가능한 망막 절편을 준비해야 합니다.