장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

운동 및 언어 기능 장애를 포함한 파킨슨병의 증상은 뇌 내 도파민 분비 세포의 활성 감소로 인해 발생합니다. 장 신경계와 후각구는 가장 노출되기 쉬운 신경 구조이며 가장 먼저 영향을 받는 부위입니다. 파킨슨병은 살충제 노출과 연관이 있는 것으로 알려져 있습니다.

살충제가 장신경계에 미치는 영향을 분석하기 위해, 마우스에게 살충제 roone을 경구 투여합니다. 그 후, 마우스의 심장 내에 4% paraform aldehyde를 관류시켜 뇌와 장신경계를 고정합니다. 조직을 추출 및 준비한 후, PD 관련 단백질에 대해 면역염색을 실시합니다.

공초점 현미경으로 획득한 Beta three tubulin 및 alpha synuclein 이미지는 살충제에 노출된 동물의 장신경계 뉴런 내에 alpha synuclein이 축적됨을 보여줍니다. 로테논(rotenone)의 전신 투여와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 로테논의 효과가 장신경계에만 국한되도록 보장한다는 점입니다. 이 방법은 파킨슨병의 병인 및 진행 기전과 같은 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술의 함의는 파킨슨병의 치료 및 진단까지 확장되는데, 이는 새로운 치료 표적과 진단 방법의 개발을 가능하게 하기 때문입니다. 이 방법은 파킨슨병의 병태생리에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 장벽뿐만 아니라 장성, 교감 및 부교감 신경계에 미치는 다른 환경 독소의 영향 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 개인은 가바지(gavage)법을 숙달하는 데 시간이 걸리므로 어려움을 겪을 수 있습니다.

저는 살충제와 파킨슨병 사이의 연관성에 관한 글을 읽었을 때 처음으로 이러한 방법들에 대한 아이디어를 얻었습니다. 또한 2005년 베를린에서 열린 세계 파킨슨 회의(World Parkinson Congress)에서 CORAs 컨퍼런스를 참관한 것이 도움이 되었습니다. 이 방법의 평화로운 시연이 필요합니다.

마우스는 인간과 해부학적 구조가 다르기 때문에 존데(gavage)를 통해 ol을 투여하는 방법은 어렵습니다. 한편, 이미지 분석은 이러한 이미지들에 맞게 최적화된 단계별 과정으로 수행되었습니다. 먼저 동물의 무게를 측정하여 프로토콜을 시작하십시오. 이후 로테논(rotenone)의 적절한 투여량을 계산하십시오.

동물 체중 1g당 0.01mL가 필요하며, 이는 kg당 5mg의 roone 용량에 해당합니다. 1mL 주사기에 roone 용액을 채운 다음, 두 번째 주사기에 vehicle 용액을 채웁니다. 마우스를 잡고 한 손으로 마우스의 꼬리를 잡습니다.

다른 쪽 손의 검지와 중지를 사용하여 목 피부를 당겨 펴줍니다. 머리가 두 손가락 사이에 고정되면, 손바닥에 기대어 머리를 아래로 돌립니다. 꼬리를 고정합니다.

네 번째와 다섯 번째 손가락을 사용하여 머리를 뒤쪽으로 고정한 상태에서 입천장을 눌러 마우스의 입을 엽니다. 존대를 입안으로 조심스럽게 삽입합니다. 존대의 전체 길이가 삽입될 때까지 위장 방향으로 천천히 밀어 넣습니다.

물질이 폐로 들어가는 것을 방지하기 위해, 엠볼루스를 가볍게 눌러 roone 용액 또는 용매를 투여하십시오. 투여가 완료되면 가바지를 천천히 추출하고, 한 케이지의 모든 동물에 대한 처리가 끝날 때까지 해당 동물을 다른 케이지에 넣으십시오. 처리 후 마우스는 4% paraform aldehyde로 심장 내 관류를 실시합니다.

PBS 내에서 해부를 통해 장을 적출한 후 15% sucrose에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 조직을 30% sucrose로 옮겨 4°C에서 다시 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후 조직을 -80°C 냉동고에 넣어 사용할 때까지 보관합니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 장 조직을 20 µm 두께로 절편합니다.

횡단면을 frost 슬라이드로 옮긴 후, 블로킹 및 면역염색 과정을 거칩니다. 이어서 anti beta three tubulin 및 Antifa synuclein 항체를 사용하여 염색을 수행합니다. 데이터의 분석은 외부 인원이 맹검법으로 수행할 것을 권장합니다.

분석을 시작하려면 Fiji 소프트웨어를 실행하십시오. 공초점 이미지 파일을 엽니다. 그 다음, 각 채널을 독립적으로 작업할 수 있도록 채널을 분리하십시오.

사용하지 않을 채널은 닫고, 분석(analyze) 및 설정(set)을 선택한 후, 스케일(scale)에서 픽셀 크기를 1로 설정하십시오. 알려진 거리(known distance)를 0.13으로 설정하고 global을 클릭하십시오. 이제 이미지 크기가 마이크론(microns) 단위로 표시됩니다.

alpha synuclein 채널을 선택하고 신경절을 선택합니다. 선택 영역이 모든 슬라이스에서 신경절을 포함하고 있는지 확인하십시오. 신경절만 선택된 상태에서 이미지를 복제하면 신경절 크기만큼의 이미지만 복제됩니다.

편집(edit)을 누르면 선택 영역 외부의 이미지 부분이 검게 변합니다. 절차가 얼마나 잘 수행되었는지 확인하기 위해 이미지를 다시 복제하십시오. 신호 대 배경 잡음비(signal to background noise ratio)가 낮은 이미지는 이미지 분석에 사용해서는 안 됩니다.

이미지 조정 임계값(adjust threshold)을 선택합니다. 그런 다음 최대 엔트로피(max entropy)를 선택하십시오. 이후 크롭된 이미지와 원본 이미지의 슬라이스들을 살펴보며 절차가 제대로 수행되었는지 확인합니다.

트로픽 임계값(tropic threshold)은 이미지 히스토그램을 기반으로 강도 신호 레벨을 선택하며, 이 임계값보다 강도가 높은 픽셀만 검은색 배경의 흰색 이미지 선택 프로세스에 표시됩니다. 그런 다음 smooth를 클릭하십시오. 이 단계는 이미지의 픽셀화된 가장자리를 부드러운 가장자리로 변환하는 선택 프로세스입니다.

그런 다음 binary를 클릭하고 Make binary를 선택합니다. 이미지가 흰색 배경에 검은색으로 표시됩니다. 복제된 이미지에서 다음 단계를 수행하려면 analyze를 클릭하고 analyze particles를 선택하십시오. 그런 다음 show outlines를 선택하고 summarize를 클릭합니다.

나머지 설정은 기본값으로 유지하십시오. 이 기능은 신호가 있는 전체 픽셀 수와 신호가 있는 픽셀들이 함께 그룹화된 전체 표면적을 인식합니다. 또한 픽셀 그룹의 수와 평균 크기가 보고됩니다.

가장 잘 조정되었으며 총 면적이 가장 넓은 슬라이스를 비교하여 선택하십시오. 선택된 슬라이스는 표시됩니다. 총 alpha synuclein 표면적, inclusion 수 및 평균 입자 크기가 포함된 데이터 표를 복사하십시오.

데이터를 Excel 스프레드시트에 붙여넣거나 다른 곳에 기록하십시오. Fiji로 돌아갑니다. beta tubulin 채널에서 이전에 선택한 슬라이스를 찾아 선택하십시오.

신경절 영역을 선택하고 analyze를 클릭하십시오. 그런 다음 measure를 선택하십시오. 그러면 신경절의 총 표면적이 표시되는 또 다른 표가 나타납니다.

표의 데이터를 alpha synuclein 측정값 근처의 Excel 스프레드시트로 추출하거나 Excel을 사용하여 다른 곳으로 복사하십시오. ganglion 표면적으로 alpha synuclein 측정에서 얻은 서로 다른 파라미터들을 나누어, 장신경계에 국소적으로 작용하는 rotenone의 효과를 분석하기 위해 ganglion 크기로 정규화된 총 alpha-synuclein 표면 및 inclusion 수를 구하십시오. 1세 된 C 57 black six 마우스에 살충제인 rotenone 5 mg/kg을 경구 투여하였습니다. 여기에 표시된 크로마토그램은 투여 1시간 후 rotenone 피크의 존재를 보여줍니다. 대조군 마우스는 20 mg/kg의 rotenone과 5 mg/kg의 rotenone으로 처리되었습니다.

여기에 표시된 바와 같이 HPLC를 통해 혈액, 뇌 및 뇌줄기 추출물의 rotenone 수치를 측정하였습니다. 5 mg/kg의 rotenone을 경구 투여했을 때, HPLC로 측정한 결과 투여 1, 2 또는 3시간 후의 혈액 내 수치는 측정 가능한 수준으로 나타나지 않았습니다. 이 그래프는 처치된 마우스의 뇌와 뇌줄기 내 rotenone 수치를 보여줍니다.

kg당 10mg 이하의 rotenone을 추출물과 함께 투여한 지 1시간 후, 뇌 또는 뇌줄기 샘플에서 rotenone 수치가 검출되지 않았습니다. 투여 1시간 후, 1.5개월 동안 처리된 마우스의 근육 및 뇌 샘플에서 미토콘드리아 complex I 활성을 평가하였습니다. 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으며 미토콘드리아 complex I의 억제가 나타나지 않았으므로, 해당 부위에 rotenone이 없었음이 확인되었습니다.

rone 투여 후 파킨슨병의 루이 소체 성분인 alpha synuclein을 분석하면, alpha synuclein의 총 표면 양, alpha synuclein 봉입체의 존재 여부 및 세포 내 alpha synuclein 패턴을 신뢰성 있게 결정할 수 있습니다. 이 그림은 여기에서 볼 수 있듯이 십이지장 및 회장 절편의 anti beta three tubulin, alpha synuclein 및 DAPI 염색 결과를 보여줍니다. 1.5개월 동안 roach known으로 처리했을 때, 3개월 대조군과 비교하여 장 신경계 신경절 내에서 alpha synuclein의 점상 패턴이 증가한 것이 확인되었습니다.

이러한 패턴은 회장과 십이지장 모두에서 관찰될 수 있습니다. 3개월의 처리 후, anti alpha synuclein을 이용한 면역 형광 염색 결과 더 큰 alpha synuclein 봉입체의 형성이 확인되었으며, theof, flavin 및 DPI를 이용한 염색에서는 3개월 시점에서만 더 큰 alpha synuclein 응집체의 집적이 나타났습니다. 이 실험은 자동 분할 및 엔트로피 기반 임계값 설정법을 사용하여 분석되었습니다.

왼쪽 그래프에서 각 열은 신경절 표면 대비 총 alpha synuclein 표면을 나타냅니다. 오른쪽 그래프에서 각 열은 채취한 신경절 표면당 alpha synuclein 봉입체의 총 개수를 나타냅니다. 종합하면, 이러한 데이터는 rotenone의 국소 투여가 장신경계 신경절에서 gliosis와 함께 alpha synuclein의 인산화, 축적 및 응집을 유도함을 시사합니다. 숙련된 경우, 정확하게 수행한다면 동물 한 마리당 1분 내에 이 기술을 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때는 가바주(gavage)를 부드럽게 삽입하는 것이 중요하며, 장애물이 느껴질 경우 이를 제거한 후 다시 절차에 따라 삽입하는 것이 좋습니다. HPLC, 면역 염색 및 이미지 분석과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다. 이를 통해 다른 부위를 분석하거나, 물질의 효과, 또는 투여 후 혈액 내 물질의 존재 여부를 분석할 수 있습니다.

이 기술은 신경과학자들이 장 신경계에 미치는 환경 신경독소의 영향을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 게이지를 올바르게 적용하고 면역화학 분석을 통해 얻은 이미지를 분석할 수 있어야 합니다. 부패한 시료를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

따라서 본 절차를 수행하는 동안 장갑과 마스크를 착용할 것을 권장합니다.