3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 ^차 Instar Drosophila 애벌레 준비

유충의 마디 신경을 시각화함으로써 축삭 수송을 연구할 수 있습니다. 3령 초파리 유충의 사례입니다. 먼저 유충을 해부하여 시각 엽, 복측 신경절 및 마디 신경을 손상시키지 않고 중추신경계(CNS)를 노출시킵니다.

절차의 두 번째 단계는 포름알데히드(formaldehyde)로 라바(lava)를 고정한 후, 1차 항체와 함께 하룻밤 동안, 그리고 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 배양하는 것입니다. 그 다음 라바를 유리 슬라이드에 마운트하여 축삭 수송 결함을 확인합니다. 단백질 국소화 및 단백질 분포는 면역형광 현미경을 통해 검사할 수 있습니다.

이 방법은 축삭 수송에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 및 근육 형태학과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 초기에는 허용 가능한 해부를 수행하는 것, 특히 뇌 분절 신경과 근육을 손상 없이 유지하는 것에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 1배 농도의 해부 버퍼 고정액, 1배 농도의 PBT 및 5% BSA 용액을 준비하십시오.

해부 전 제시된 표에 상세히 설명된 대로, 해부를 시작하기 위해 깨끗한 5번 핀셋 한 쌍, 깨끗한 직선형 가위 한 쌍 및 핀을 준비하십시오. 마이크로 스푼을 사용하여 특정 유전형을 가진 3령 애벌레를 페트리 접시에 수집하십시오. 그런 다음, 탈이온수로 채워진 페트리 접시에서 애벌레를 헹구어 모든 먹이를 제거하십시오.

다음으로 larva를 등면이 위로 오도록 S 가드 디쉬 위에 놓습니다. larva의 앞끝과 뒷끝을 핀으로 고정합니다. 고정된 larva 위에 미세 가위를 사용하여 일회용 해부 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.

후단 근처의 등쪽 정중선에서 cuticle을 살짝 집으십시오. 가위를 사용하여 후단부터 전단까지 cuticle을 절개하십시오. 절개된 부위에 new one times dissection buffer 한 방울을 떨어뜨리십시오.

핀을 사용하여 유충 중앙 부근 큐티클의 한쪽 측면 가장자리를 잡고, 다른 핀을 사용하여 큐티클을 고정합니다. 큐티클의 반대쪽 측면 가장자리에도 핀을 꽂아, 도식에 표시된 것처럼 양측면에 각각 두 개의 핀이 사용되도록 합니다. 이제 장과 지방체, 기문을 조심스럽게 제거하여 두 개의 시엽과 복신경절이 포함된 뇌만 남깁니다.

분절 신경을 부착시킨 후, 가드 디쉬에 유충을 부착한 상태에서 고정 및 항체 염색을 수행합니다. 해부된 유충을 50 µL의 고정액에 넣고 30분 동안 배양합니다. 15분마다 고정액을 교체해 줍니다. 고정이 끝나면 1x PBT에서 유충을 30분 동안 세척합니다.

10분마다 완충액을 교체할 때, 유충이 항상 완충액에 잠겨 있어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 5% BSA 용액으로 적절한 농도까지 희석하여 1차 항체 용액을 준비하십시오. 최적 농도는 항체마다 다릅니다.

플라스틱 접시에 물에 적신 Kimwipe를 깔아 습윤 챔버를 제작합니다. PBT를 마지막으로 교체합니다.

준비된 1차 항체 용액으로 헹군 다음, 가습 챔버에서 4°C로 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 해부된 유충을 1x PBT로 30분 동안 헹구되, 10분마다 버퍼를 교체해 줍니다. 5% BSA 용액으로 2차 항체를 적절한 농도로 희석하여 준비합니다.

일부 2차 항체는 빛에 민감하므로 습윤 챔버를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 유충을 25 °C의 2차 항체 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양이 완료되면, 10분마다 버퍼를 교체하며 1배 PBT로 30분 동안 유충을 세척하고, 슬라이드에 고정하기 전에 해부한 유충을 마운팅하고 시각화하는 과정을 진행합니다.

다이어그램에 표시된 것과 같이 커버 슬립이 놓일 수 있을 정도의 충분한 간격을 두고 슬라이드 중앙에 매니큐어를 사용하여 두 개의 수직선을 그어 슬라이드를 준비합니다. 매니큐어가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 이 이미지에 표시된 것과 같이 슬라이드 위의 수직 매니큐어 선 사이의 공간에 마운팅 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.

이제 슬라이드를 마운트할 준비가 되었습니다. 마지막 PBT 처리 시간이 지난 후 유충을 회수하십시오. 헹군 뒤 유충에서 측면 핀을 조심스럽게 제거하십시오.

큐티클이 찢어지지 않도록 주의하십시오. 남은 핀 두 개를 제거하고 핀셋으로 유충을 집어 준비된 슬라이드 위에 올립니다. 유충이 뒤집히지 않고 복측이 아래로 향하도록 배치하십시오.

커버 슬립을 조심스럽게 위에 덮고, 여기 그림과 같이 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 이제 유충을 형광 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 이 대표 이미지는 시냅스 소포 단백질인 cystine string protein에 대한 항체로 염색한 야생형 유충의 모습입니다.

lava 분절 신경이 매끄럽게 염색되었습니다. 여기서는, 운동 단백질 돌연변이체인 lava를 CSP 항체로 염색하였습니다. 분절 신경에서 CSP가 밝게 염색되는 거대한 축적물이 관찰됩니다.

이 절차를 수행할 때, 뇌에 연결된 분절 신경을 유지하고 근육을 온전하게 보존하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 해부 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 형광 현미경을 이용하여 축삭 수송을 연구하기 위해 면역 염색된 3일 차 유충 분절 신경을 고정하십시오.