표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제

Mex B 막 단백질을 정제하기 위해, 먼저 재조합 DNA 방법을 사용하여 e coli에서 Mex B를 발현시킵니다. 그 다음 막을 분리하고 온화한 계면활성제를 사용하여 막 단백질을 가용화합니다. 가용화된 막 단백질은 iMac을 통해 정제되며, 이후 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가로 정제합니다.

단백질의 정제 수준은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS poly ACRYLAMIDE Gel electrophoresis)을 사용하여 결정합니다. 이 절차는 다약제 내성 막관통 수송체에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 막 단백질에도 적용될 수 있습니다. 오늘 시연할 절차는 저희 연구실의 대학원생이 수행할 것입니다. 이 절차를 위해, Pseudomonas aeruginosa 유래의 Mex B를 PET 30 B plus 발현 벡터에 서브클로닝하여 Mex B가 C-말단 His-tag와 함께 발현되도록 합니다. 저녁에 신선한 형질전환체 또는 냉동 스톡을 사용하여 3 mL LB kan mycin 배양액 4개에 접종하고, 37 °C의 롤러에서 하룻밤 동안 배양합니다.

하룻밤 배양한 배양물을 사용하여 밀리리터당 30 µg의 Kan Mycin이 포함된 150 mL LB 배지에 접종하십시오. 오후에 37 °C 쉐이커에서 배양물을 성장시키십시오. 이 소량 배양물을 사용하여 밀리리터당 30 µg의 Kan Mycin이 포함된 1 L XYT 배지 6개에 접종하십시오.

고사리 배양 플라스크에 마이신을 첨가할 수 있습니까? 1:40 희석 비율로 배양당 25 milliliters를 사용하십시오. 배양액의 광학 밀도에 도달할 때까지 37 degrees Celsius에서 배양하십시오.

0.4에서 0.6의 600nm 흡광도까지 약 1.5시간 동안 배양합니다. 배양액이 적정 밀도에 도달하면, 0.5 mL의 1 M IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 모든 플라스크를 다시 쉐이커에 넣고 30 °C에서 하룻밤 동안 계속 배양한 후, 다음 날 아침에 박테리아를 회수합니다.

셰이커에서 배양액을 꺼내어 냉각합니다. 그 다음 세포를 수확하기 위해, 배양액을 원심분리 튜브로 옮기고 대형 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 5,000 rpm으로 30분 동안 원심분리합니다. 세포가 원심분리되는 동안, 100 mL의 세포 재현탁 완충액에 DNAse 단백질 분해 효소 억제제와 라이소자임을 첨가합니다.

또한 이 표에 표시된 대로 membrane Resus suspension Buffer 두 분주량에 프로테아제 억제제를 첨가하십시오. 원심분리가 완료되면 세 가지 용액을 모두 얼음에 보관하십시오. 세포 펠렛을 100 milliliters의 cell resus suspension Buffer로 재현탁하십시오.

다음으로, 세포를 파쇄합니다. 세포 현탁액을 French 압력 셀에 넣고, 이를 French press에 장착합니다. 압력이 12,000 pounds per square inch에 도달할 때까지 가압합니다.

파쇄된 세포가 조금씩 흘러나오도록 밸브를 아주 조금만 엽니다. 밸브를 너무 많이 열어 세포가 갑자기 뿜어져 나오게 하면 압력이 너무 낮은 상태로 방출되어 효율적인 파쇄가 이루어지지 않으므로 주의해야 합니다. 세포 용해물을 얼음 위에 차갑게 보관된 병에 수집하십시오.

세포 용액을 12,000 psi의 압력으로 French pressure cell에 다시 통과시킵니다. 세포 용해물을 SS 34 원심분리관으로 옮긴 후, SS 34 로터를 사용하여 4 °C에서 10,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 다음 단계는 정제된 용해물을 준비하는 것입니다.

막 분획을 준비하는 데 사용됩니다. 상층액을 ti. 6 4, 7 0.5 초원심분리 튜브에 조심스럽게 옮긴 후, TI 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 4°C에서 40,000 rpm으로 50분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버립니다. 피펫을 사용하여 약 25 milliliters의 membrane Resus suspension buffer에 세포막이 포함된 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 막 현탁액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 4°C에서 40,000 rpm의 TI I 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 50분 동안 다시 원심분리한 후, 세척된 막 펠렛을 25 milliliters의 membrane Resus suspension buffer에 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 막에 약 25 milliliters를 가하여 막 단백질을 가용화합니다.

최종 세제 농도가 2% DDM이 되도록 10% DDM 6 mL를 첨가하고, 4°C에서 2시간 동안 혼합물을 천천히 흔들어 줍니다. DDM 존재 하에 2시간 동안 배양한 후, 용해성 단백질 세제 복합체를 불용성 단백질로부터 분리하기 위해 TI I 6 4 7 0.5 로터를 사용하여 4°C에서 40,000 rpm으로 40분 동안 혼합물을 원심분리합니다. MexB 단백질 세제 복합체가 포함된 상층액을 보관하여 정제에 사용합니다. MexB 단백질 세제 복합체가 포함된 상층액을 Resus 현탁 완충액으로 평형화된 이온 금속 친화성 비드 2 mL와 혼합합니다. 4°C의 롤러에서 1시간 동안 배양하여 단백질을 수지에 결합시킵니다.

슬러리를 중력 흐름 컬럼 본체에 붓고 통과액은 버립니다. 컬럼 세척이 완료되면 20 mL 또는 10 컬럼 부피의 iMac 결합 및 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 10 mL의 iMac 용출 버퍼를 사용하여 결합된 단백질을 용출합니다.

각 용출 분획에서 10 µL의 샘플을 취합니다. 2배 농도의 SDS 샘플 버퍼 10 µL와 혼합한 후, 10% 폴리아크릴아마이드 SDS 젤에서 분석합니다.

각 분획 내 mex B의 양과 순도를 추정하십시오. Mex B 단백질 세제 복합체가 포함된 분획을 회수하고 4°C에서 원심분리 농축기로 농축하십시오. 이 단계에서 단백질이 침전되지 않도록 주의하십시오.

여러 번의 짧은 원심분리를 수행하며 침전물이 생기는지 확인하십시오. 각 원심분리 후, 모아진 분획들을 젤 여과 컬럼을 사용하여 정제하십시오. super rose 12 HL 30 over 10 컬럼을 24 milliliters의 running buffer로 사전 평형화하고 베이스라인이 안정될 때까지 기다리십시오.

다음으로, 액터 시스템 로딩 루프를 러닝 버퍼로 헹굽니다. 단백질을 컬럼에 적용하기 전에 시린지 필터를 사용하여 단백질 용액을 여과합니다. 그런 다음, 단백질 농도가 최대 5 mg/mL인 단백질 용액을 최대 240 µL까지 컬럼에 로딩합니다.

1.5 컬럼 부피의 완충액을 흘려주고 0.25 mL씩 분획하여 수집합니다. XB 단백질 세제 복합체는 용출 부피 약 10에서 15 mL 부근에서 피크 형태로 용출됩니다. 피크 분획에서 5 µL의 샘플을 취합니다.

각 샘플을 2배 농도의 SDS 샘플 버퍼와 1:1 비율로 혼합합니다. 10% poly acrylamide gel에서 샘플을 분석하여 각 분획 내 Mex B의 양과 순도를 추정하고, 순수한 Mex B가 포함된 분획을 회수합니다. 이 poly acrylamide gel에는 iMac 컬럼에서 회수한 분획과 겔 여과 컬럼의 개별 분획들이 로딩되었습니다. 겔 여과 컬럼 단계를 거친 후, Coomassie 염색된 poly acrylamide gel에서 단백질이 순수하게 나타납니다.

겔 여과 컬럼의 트레이스(trace)는 컬럼에서 용출되는 단백질-계면활성제 복합체의 메인 피크를 보여줍니다. mxb 단백질의 평균 수율은 2 XYT 배양액 6L당 약 2mg입니다. 이 절차를 충분히 숙달하고 적절하게 수행한다면 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 막 단백질을 발현, 가용화 및 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.